O pentobarbital potencializa os efeitos sedativos e depressores cardiorrespiratórios de outros anestésicos.
Possui antagonismo a metadona, cetamina, clonazepam, doxiciclina, dietilestilbestrol, estradiol, xilazina, ácido ascórbico e sinergismo com hidroxizine, fentanil, dexclorfeniramina, Clorfentramida e citrato de fentanila.
Além disso, esta medicação aumenta a hepatotoxicidade do paracetamol e podem mascarar os sintomas respiratórios da superdosagem com ácido acetilsalicílico.