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宫颈癌 - Coggle Diagram
宫颈癌
人乳头瘤病毒HPV
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是一类无包膜的小DNA病毒，可感染人皮肤和黏膜的上皮细胞，引起不同程度的良性或恶性增生性病变。HPV具有严格的组织特异性，用HPV直接进行动物实验有一定困难。由于HPV的生活周期与上皮细胞的分化紧密联系，因此，HPV在体外常规单层细胞培养中产生感染性病毒颗粒比较困难。欲在体外完成类似于体内的生活周期，产生HPV病毒颗粒，需要适当的细胞以及能支持类似体内鳞状分化的培养技术。
依赖于阴道微生物群组成的形态学评估的流行病学研究表明，大量乳酸杆菌的存在与性传播病原体（包括淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和 HIV 感染风险较低）相关。一般来说，厌氧菌百分比高、乳酸杆菌含量低的微环境更容易感染HPV，即乳酸和低pH值被认为是防止性传播感染的主要因素。有研究发现，HPV不一定足以诱导宫颈阴道微生物群的变化。与健康女性相比，HPV感染增加了阴道细菌多样性，导致HPV感染女性阴道微生物群发生差异性改变。（见文献：微生物群和HPV：病毒感染对阴道微生物群的作用2022 Journal of Medical Virology IF 20.693)（文献：宫颈阴道微生物群-宿主相互作用调节沙眼衣原体感染 2017，mBio ，IF 7.786 https://journals.asm.org/doi/10.1128/mBio.01548-19）
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类器官
化学治疗是大肠癌最基本的治疗手段之一，但现有的化疗方案有效率较低，肿瘤耐药导致的化疗失败是进展期大肠癌病人死亡的主要原因，目前临床上缺乏预测大肠癌化疗效果的有效手段。现有的预测大肠癌化疗疗效的标志物在临床应用过程中存在很大的局限性，受到阳性率低和准确性差的制约；而应用动物成瘤模型进行的药物敏感性试验费时费力，缺乏临床应用的时效性，且与人体肿瘤存在一定的差异。类器官培养技术的发展有望解决上述问题。大肠癌的类器官培养能够模拟体内肿瘤组织的生长特点和微环境，客观地反映对肿瘤组织对药物的反应过程。更重要的是，类器官培养能够在短期内完成大肠癌细胞体外增殖和药物筛选平台的构建，及时快速地进行药物敏感性检测与药物筛选。我实验室系统地研究了大肠癌的类器官培养与化疗疗效预测，拟通过本研究深入探讨类器官培养对于大肠癌化疗疗效预测的价值并有望筛选化疗耐药基因。
骨科课题：三维体系生物微环境让干细胞通过机制尚不明确的自组装形式定向分化为器官组织特异的功能细胞，这仍然是生物医学界构建类器官仅有的成功模式(Nature 2019, 565:510; Nature 2020, 582:399)。骨因其力学特征，还需要力学支撑。所以，本研究兼顾两者开始了原始的创新工作。取得成果如下：1）骨细胞Wnt-Jag1-Notch信号轴的促进骨形成的作用与机制。发现骨细胞Wnt三大生物学功能：促骨形成、骨吸收和干细胞增殖。揭示了体内骨细胞与骨髓基质细胞(BMSC)相互作用，调控干细胞自我更新、成骨与溶骨的作用分子机制。发现了骨细胞Notch抑制骨形成；骨细胞-Jag1的功能；明确了骨细胞Wnt微环境及其脱细胞支架对临界骨缺损的快速修复功能。2）研制了生物材料与细胞一体化3D生物打印设备、产生国际领先的打印技术。功能模块，在体外培养时保证细首次仿生骨的理、化、生物微环境，构建了骨组织修复胞的高存活率（94%），利于细胞生长、增殖、成骨分化和成血管化。建立两级正压、万级无菌器官培养室，具有生物力学加载和低氧仿真培养系统。精准构建骨理、化和生物微环境，实现细胞和组织发育精准调控、成骨定向分化；体外实现了骨形成。3）筛查并发现指导骨类器官构建关键因子。转录组RNAseq分析，鉴定诸多发育信号。明确骨细胞-Notch配体成骨作用，优化了骨类器官的构建。发现了DNA甲基化修饰调节干细胞成骨分化。甲基化酶Dnmts抑制剂5-AZA增强hMSCs成骨分化，增强植入后骨的形成。发现LMP-1分子增加BMP4/7表达，重构细胞外基质微环境、促进骨形成。4）采用动物模型评价骨类器官功能，实现其体内功能重建。骨细胞Wnt功能模块快速修复小鼠顶骨临界骨缺损；PTH(1-34)复合水凝胶支架Gel-nHAP-PTH修复大鼠顶骨缺损；新型骨生长因子BB-1骨修复材料促进恒河猴椎间融合；研发了Wnt激活骨细胞的脱细胞外基质制备工艺，证明其产生良好骨修复效果和临床转化应用前景。总之，骨科现有植入物是纯材料或者材料加涂层，缺乏细胞或者生物学活性。本项目解决了材料里细胞存活、分化、矿化等卡脖子问题。取得的研究成果可以转化应用科研和临床，移植体内修复骨损伤；为相关产品的临床转化奠定了基础；促进干细胞与发育生物学的技术和理论服务于人类健康。
体外类器官培养平台建立；类器官细胞培养与手术切除标本的原发肿瘤细胞进行全基因组对比分析（可从SNV、拷贝数等对体外培养的类器官与原发肿瘤相比较，最希望达到体外类器官培养保留了原发肿瘤的遗传特性，在基因组上的差别微乎其微，这样就可以用于药敏试验与药物筛选的研究。）；癌症的体外药物敏感性测定与药物筛选；癌症类器官药敏试验结果与临床药物治疗的相关性进行分析。（见结题项目：基于大肠癌类器官培养技术的化疗敏感性与药物筛选的转化研究）
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癌症细胞系能模拟原位肿瘤的遗传异质性并适用于高通量药物筛选，但是不能模拟癌症微环境。近年来，原位肿瘤来源的类器官体能反映原位肿瘤组织的病理结构和体内微环境，有潜力解决癌症细胞系面临的难题。类器官不仅保留了与体内器官高度相似的组织学、遗传学特点，同时形成的组织有干细胞增殖与分化潜能。肿瘤类器官与肿瘤的高度相似性，在抗癌新药研发平台和个性化精准治疗中展现出广阔的前景。
药敏试验：个体化/精准医疗是未来的癌症新药研发和应用的发展方向，即针对不同的病人使用不同的方案以达到精准治疗的目的。大多数用于癌症治疗的药物具有较强毒副作用，若能因人施药，精准用药不仅能够减少药物对患者带来的毒副作用，提升治疗效果，而且还能极大的节约治疗成本，具有重大的现实意义与应用价值。随着相关技术的不断发展，肿瘤精准治疗进入个体化时代：一是利用高通量基因测序发现肿瘤相关突变，寻找药物靶点；二是利用肿瘤模型测试靶向药物的敏感性。
Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer患者来源的类器官模拟宫颈癌中的宫颈组织动力学和病毒肿瘤发生2021Cell Stem Cell (IF 25.269)
迄今为止，宫颈癌研究依赖于数量有限的细胞系、异种移植和转基因小鼠模型。使用细胞系对临床前测试的价值是有限的。器官筏培养能够支持病毒的生命周期，但不能维持超过 2-3 周。异种移植模型这种宫颈癌模型的生成效率很低。
构建宫颈外和宫颈内类器官。模拟病毒感染潜力：用tdTomato 标记的 1 型生殖器单纯疱疹病毒 (HSV-1) 感染了宫颈外和宫颈内的类器官系，可在两者中都出现了清晰的荧光信号，暴露后 24 小时已经存在谱系，表明感染成功，使用 tdTomato 标记的病毒，可以通过两个类器官系统中的活细胞成像，随着时间的推移在视觉上跟踪病毒感染。因为这种病毒的特点是溶解在暴露的时间过程中，受感染的类器官的裂解繁殖周期、衰弱/崩溃和死亡在视觉上变得明显。感染后的一周内观察到病毒DNA 含量显着增加，证实病毒能够在两种类器官中轻松复制。
将巴氏试验引入临床有助于快速早期诊断宫颈异常，是一种收集宫颈细胞的非侵入性策略，该方法可以获得的组织数量有限且完整性差，因此，无法与匹配的起源肿瘤组织进行直接组织学比较。当收集到的材料量足够时，刮下的较大组织被保留下来用于组织学、转录组学或基因组学分析。由于其富含血细胞，本文开发了一种快速消化方案来处理收集的材料，其中包括用胶原酶溶液进行初始处理，然后进行红细胞裂解，随后将消化的材料嵌入 BME 中并在完全培养基 (M7) 中培养，为健康的宫颈外培养进行了优化。
最常见的亚型是鳞状细胞癌 (SqCa) 和腺癌 (AdCa)，分别占所有病例的 70% 和 25% 。这些肿瘤起源于子宫颈的不同区域：外宫颈管、内宫颈管和转化区。外宫颈内衬有复层鳞状上皮，是 SqCa 的起源，而宫颈内膜由可产生 AdCa-s 的腺柱状细胞组成。
宫颈内和外宫颈上皮细胞表现出不同的形态和转录特征。宫颈管是腺体单层上皮，具有明显的分泌特性，可发挥其主要功能：提供粘液以润滑宫颈管。相反，分层的宫颈外结构由基底细胞维持，这些细胞经历增殖和分化形成动态的多层鳞状上皮，其主要具有保护功能。为更好地表征已建立的培养系统，对两种类器官谱系的基因表达谱和组织学特性进行了分析。主成分分析 (PCA) 揭示了类器官和各自起源组织之间的可比基因表达模式。表达谱通过免疫组织化学分析验证，标准苏木精和伊红(H&E)染色揭示了宫颈内器官的极化单层结构，而在宫颈外器官中观察到分层的多层表型。
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Patient-derived and mouse endo-ectocervical organoid generation, genetic manipulation and applications to model infection患者来源和小鼠宫颈内器官的生成、基因操作和模拟感染的应用2022 Nature Protocols (IF 17.021)
子宫颈包括两个区域：柱状上皮衬里的宫颈内膜和复层鳞状上皮衬里的外宫颈，在鳞柱过渡区汇合。到目前为止，遗传不稳定的永生化或癌细胞系的二维培养物主要用于体外研究宫颈生物学。缺乏反映两种上皮类型的细胞、生理和功能特性的体外系统阻碍了正常生理学的研究，疾病发展和感染过程。在这里，我们描述了一种用于从人体活检和小鼠组织中分离、建立、长期培养和扩增成人上皮干细胞衍生的宫颈和宫颈外器官的方案。
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阴道微环境
1）乳酸杆菌在阴道健康中起着重要作用，它的关键作用之一是维持相对酸性的环境并产生保护性蛋白质作为抵御病原体的第一道防线。乳酸杆菌使用两种机制来防止病原体。乳酸杆菌通过粘附在粘液上产生生物膜和屏障，从而竞争并防止病原体定植。它进一步生产保护性抗菌化合物，包括细菌素样物质、生物表面活性剂、过氧化氢和乳酸。因此，健康的阴道微生物组被认为是以乳酸杆菌为主的微生物组。2）乳酸杆菌的耗竭可导致促炎环境，这可以促进病毒转化的几个必要步骤，包括E6和E7表达，基因组不稳定性，病毒整合和端粒酶活化，这是致癌所必需的。3）在一些但不是全部女性中，乳酸杆菌主导状态在月经期间消失，而在其他女性中，它似乎在月经期间相当稳定，而在另一位女性中，它可以每天变化。其他环境因素，如抗生素使用，尼古丁使用，阴道冲洗，怀孕和母乳喂养，避孕，合并感染和最近的与乳酸杆菌短暂减少的状态有关，这种短暂性丢失的临床意义尚不清楚。
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宫颈癌类器官
目前已成功新构建出一批宫颈癌类器官模型（PDO）及部分宫颈癌PDOX小鼠模型，并且对模型进行了以下验证：1）模型的组织病理学结构（HE&IHC）；2）模型的连续多代次稳定扩增和传代性能；3）部分宫颈癌类器官体内成瘤模型构建，PDOX模型；4）部分模型进行了OncoCode Panel（673基因）NGS 检测；5）高危型HPV-16、HPV-18亚型E6和E7的表达验证。这些宫颈癌类器官模型可作为宫颈癌生物标志物发现与鉴定、宫颈癌药物研发及宫颈癌临床医学转化研究的工具，为新药研发企业及各大科研院所提供相关的研发技术服务。
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