Além disso, existiam questões territoriais também no sul do Brasil que precisavam ser regulamentadas. Em 1750, as Coroas espanhola e portuguesa assinaram o Tratado de Madri, destinado a definir um limite real das colônias sul-americanas. Esses limites foram inspirados no princípio do Direito Privado Romano, o qual afirma que aquele que ocupa a terra tem o direito de posse sobre ela (uti possidetis). Acreditava-se que, respeitados os limites do novo tratado de fronteira, Portugal e Espanha colocariam fim aos conflitos relacionados a disputas territoriais. Pelo Tratado de Madri, Portugal cedeu a Colônia do Sacramento, o primeiro povoado das terras que hoje constituem o Uruguai e a cidade mais antiga do país. A Espanha cedeu Boa parte do território que forma hoje os estados do Sul brasileiro, incluindo as missões jesuíticas espanholas conhecidas como Sete Povos das Missões. Esse conjunto de sete missões indígenas criadas pelos jesuítas havia sido constantemente atacado pelos bandeirantes, para aprisionar os indígenas guaranis e vendê-los aos fazendeiros paulistas. A Espanha cedeu também as terras de Mato Grosso e Goiás, onde o ouro já era intensamente explorado pelos portugueses, além de terras na Amazônia, que nem eram ocupadas. O Tratado de Madri foi a principal base da configuração territorial do Brasil, restando apenas algumas partes para preencher o território com a conformação atual. Embora anulado pelos espanhóis em 1761, os limites estabelecidos serviram de referência para outros acordos internacionais posteriores.