Se une a la subunidad 50S del ribosoma bacteriano inhibiendo la síntesis de proteínas. Es efectiva frente a un amplio espectro de microorganismos y, al igual que otros antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas, la eritromicina es bacteriostática. Su actividad frente a gérmenes gram-positivos es mayor que frente a los gram-negativos, debido a su mejor penetración en los primeros.
Los microorganismos gram-positivos susceptibles a la eritromicina incluyen los Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, S. pyogenes, S. pneumoniae, grupo S. viridans, y Corynebacterium diphtheriae. Otros gérmenes que suelen ser susceptibles son la Chlamydia trachomatis, Entamoeba histolytica, Listeria monocytogenes, Borrelia burgdorferi, Mycoplasma pneumoniae, Treponema pallidum, y Ureaplasma urealyticum.