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1.3. Espectrometría de absorción molecular - Coggle Diagram
1.3. Espectrometría de absorción molecular
El análisis por espectrometría de absorción molecular puede ser:
El análisis
cuantitativo
. Se realiza con radiaciones del UV-VIS y se fundamenta en la ley de Lambert-Beer. Es el análisis más usado en los laboratorios de bioquímica y permite obtener información de las magnitudes bioquímicas, al comparar la radiación absorbida por una solución que contiene una concentración desconocida de una molécula con una que contiene una concentración conocida de la misma molécula.
Análisis
cualitativo
. Se realiza con radiaciones del IR y en el laboratorio clínico se usa principalmente para análisis de la composición de cálculos urinarios.
1.3.1. La absorción molecular
Transmitancia, absorbancia y espectro de absorción
El espectrofotómetro puede calcular la intensidad de luz absorbida midiendo el resultado de dividir la intensidad de luz transmitida (It) entre la intensidad de luz incidente (I0). Este cociente recibe el nombre de
transmitancia
(T). El valor de esta magnitud no tiene unidades, está comprendido entre 0 y 1 (0% y 100%):
0 (o 0%): no se transmite luz; por tanto, la absorción es total.
1 (o 100%): se transmite toda la luz; por tanto, no existe absorción.
La
absorbancia
es el logaritmo inverso o negativo de la transmitancia: A = log = –log T
El
espectro de absorción
es el conjunto de bandas (transiciones electrónicas) que indican la cantidad de luz absorbida por una sustancia a diferentes valores de longitud de onda, y es único o característico de cada sustancia.
1.3.2. La ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer enuncia que la absorbancia de un analito es directamente proporcional al coeficiente de absorción de la molécula, a la distancia recorrida por el haz de luz en la disolución y a la concentración de dicho analito. A = e ∙ b ∙ c
Linealidad y desviaciones de la ley de Lambert-Beer
La
linealidad
es el intervalo de concentraciones entre las cuales existe una relación lineal entre la concentración y la absorbancia (es decir, se cumple la ley de Beer).
Las
desviaciones
de la ley de Beer pueden causarlas diversos factores, instrumentales o químicos.
Desviaciones instrumentales
Alteraciones en la luz incidente.
Errores en la rendija de salida
La cubeta
El detector
Desviaciones químicas
. Es necesario controlar el pH de la solución, ya que a diferentes pH se absorben diferentes longitudes de onda.
Otros factores que se deben tener en cuenta son:
Si la absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto.
Si hay interferentes.
Si existe fenómeno de fluorescencia.
Si se pueden producir reacciones químicas entre compuestos que den lugar a otros cromógenos.
1.3.3. Instrumentación: espectrofotómetro UV-VIS
Las características técnicas de un espectrofotómetro sencillo podrían ser: dos lámparas, una para UV y otra para VIS para un rango de 200-1.000 nm, ancho de banda espectral 4 nm, haz simple, red de difracción de 1.200 líneas/mm, detector de fotodiodos y con posibilidad de 4 cubetas de 10 mm.
Manejo del espectrofotómetro UV-VIS
Selección de la lámpara: deuterio (UV) o tungsteno (VIS).
Ajuste del 0% de transmitancia, las llamadas corrientes oscuras.
Selección del modo de medida: absorbancia o transmitancia.
Selección de la curva de calibración adecuada a la muestra que se va a medir: en esta curva se incluye el blanco de reactivos, 100% de transmitancia.
Selección de la longitud de onda.
Medición de la muestra problema.
Puesta en marcha: se enciende el aparato y se esperan unos 20 minutos de calentamiento.
1.3.4. Curvas de calibrado
1.3.5. Mediciones a punto final, cinéticas y enzimáticas
1.3.6. Espectrometría de absorción molecular en el infrarrojo