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RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS DE PADRONIZAÇÃO DE PCR CONVENCIONAL - Coggle Diagram
RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS DE PADRONIZAÇÃO DE PCR CONVENCIONAL
PCR check
Desenho de primer
5’-3’
para sintetizar o primer reverso deve inverter a sequência das bases
tamanho do primer
quanto maior o número de bases mais específico o primer
ideal entre 20 a 25 pb
conteúdo CG
indicado que não tenha uma quantidade superior a 60%
superior a 60% usa-se adjuvantes
DNA
qualidade
verificação no gel de agarose
quantidade
o número de amplicon varia com o número inicial de fitas
pureza
espectrofotometria
presença de DNA em relação a proteínas
Condições do Mix
tampão
utilizar sempre o que é fornecido pelo produtor da enzima
dNTPs
se congelada e descongelada muitas vezes perde a função
MgCl
ficar atento à concentração
Enzima
Lotes de produção
variação de produção pode tornar os reagentes inviáveis
Protocolo de amplificação
controles positivos e negativos
temperatura de anelamento
ajustar conforme as condições trabalhadas
tempo
Equipamentos
ficar atento à calibração
Eletroforese
tampão
não pode ser utilizado muitas vezes
padrão de bandas
voltagem da fonte
voltagem muito alta pode deformar o padrão de bandas
Possíveis situações
Controles positivos que amplificaram e não amplificam mais
possível causa: DNA degradado
Resultados variantes entre réplicas de controle positivo em uma mesma reação e mix único
erro na pipetagem; problemas no equipamento
Reação funcionando perfeitamente e para de funcionar
problemas com reagentes: conferir o tampão
Processo de padronização
definição de um processo
planejamento das etapas
avaliação de controles positivos e negativos
repetições em números conforme descritos no processo
aplicações com reagentes diferentes e avaliação de compatibilidade de resultados
troca de manipuladores
registrar todas as atividades
Processo de monitoramento
sistema de gestão de qualidade
padronizar sistemas
investigar e tratar desvios
minimizar e antever não-conformidades
garantir a rastreabilidade dos ensaios