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CRESCITA MICROBICA, image - Coggle Diagram
CRESCITA MICROBICA
DEFINIZIONE
(1)
- la crescita microbica è definita come un aumento del numero di cellule in una popolazione
- durante la divisione cellulare , una cellula diventa due con la fissione bianaria
- durante il tempo necessario per il verificarsi (tempo di generazione) il numero totale di celle e la massa raddoppiano
(2)
equazione di crescita
- modello di aumento della popolazione in cui il numero di cellule raddoppia in un intervallo di tempo costante
- N=N0•2^n
- N è il numero finale delle cellule, N0 è il numero iniziale e n è il numero di generazioni durante il periodo di crescita esponenziale
- il tempo di generazione g della popolazione in crescita esponenziale è t/n, dove t è la durata della crescita esponenziale
- linearizzo l'equazione esponenziale in logaritmo: logN/N0=nlog2
- introduco il tempo di generazione e lo sostituisco ad n:
n=t/g => logN/N0=log2/g•t
dove log2/g è una costante, ossia lo slope nel grafico in cui y= cellule/ml e x=tempo
- altro parametro importante è la costante di velocità di crescita k è definita come il numero di generazione in unità di tempo:
k=n/t=1/g
=> parametri per descrivere quantitativamente la velocità di crescita data la pendenza della retta (slope):
slope=k•log2
(3)
fasi di crescita
- per diverse ragioni, un organismo che cresce in un contenitore chiuso non può crescere in modo esponenziale per un tempo indefinito
- si ottiene una curva di crescita tipica per la popolazione, ossia gaussiana
- la curva di crescita descrive un intero ciclo di crescita e include fasi di latenza (lag), esponenziale, stazionario e morte
(1)
fase lag
- quando coltura microbica viene inoculata in un nuovo mezzo di coltura la crescita inizia solo dopo un periodo di tempo chiamato fase di latenza
- se una coltura in crescita esponenziale viene trasferita nello stesso mezzo alle stesse condizioni di crescita (temperatura, areazione etc.) non vi sarà sostanzialmente alcun ritardo e la crescita esponenziale inizierà immediatamente
- per crescere in qualsiasi terreno di coltura le cellule devono avere gli enzimi necessari per la sintesi dei metaboliti essenziali non presenti in quel mezzo
- quindi, se le cellule vengono trasferite in un terreno minimo, i metaboliti essenziali devono essere biosintetizzati ed è necessario il tempo per la sintesi dei nuovi enzimi richiesti per produrre un piccolo pool di ciascun metabolita
(2)
crescita esponenziale
- durante la crescita esponenziale la popolazione cellulare raddoppia a intervalli regolari per un periodo breve esteso a seconda delle risorse disponibili e di altri fattori
- le cellule di fase esponenziale sono in genere nel loro stato più sano e sono quindi più desiderabili per gli studi dei loro enzimi ed altri componenti cellulari
- in generale i procarioti credono più velocemente microrganismi eucarioti e piccoli eucarioti tendono a crescere più velocemente di quelli grandi
- in questa fase non vi sono alte concentrazioni di metaboliti secondari, quindi organismi sono sani e attivi
(3)
fase stazionaria
- la crescita diventa limitata perchè o una sostanza nutritiva essenziale nel mezzo in coltura è esaurita o i prodotti di scarto dell'organismo si accumulano
- quando la crescita esponenziale cesso per uno o entrambi i motivi la popolazione entra in fase stazionaria
- nonstante l'arresto della crescita il metabolismo energetico e i processi biosintetici nelle cellule possono continuare, ma normalmente ad. una velocità ridotta
- alcune cellule possono dividersi in fase stazionaria ma ciò non provoca l'aumento netto di popolazione delle cellule in quanto altre muoiono
=> crescita criptica in cui i due processi si bilanciano
- successivamente la popolazione entrerà in fase di morte
(4)
crescita diauxica
- due distinte fasi di crescita separate da una fase di stasi
- in presenza di due fonti di carbonio, si ha un uso preferenziale di una sola delle due
- nel caso di esaurimento di glucosio E.coli entra in fase lug e riprende successivamente la sua crescita con consumo di lattosio => si riprogramma
(5)
chemostato
- dispositivo di coltura continua, sistema chiuso in cui un volume noto di terreno fresco viene aggiungo ad una velocità costante mentre un volume uguale di terreno di coltura esaurito viene rimosso alla stessa velocità
- dispositivo in cui sia tasso di crescita (quanto velocemente le cellule si dividono) sia densità cellulare possono essere controllate indipendentemente
- due fattori governano la velocità e la densità:
- il tasso di diluizione: velocità alla quale viene pompato il medium fresco e il medium esaurito viene rimosso
- concentrazione di un nutriente limitante
- ad un tasso di diluizione alto l'organismo non cresce abbastanza velocemente rispetto alla sua diluizione quindi viene eliminato
- ad un tasso di diluizione basso le cellule possono morire perchè il nutriente limitante non viene aggiunto abbastanza velocemente da supportare il metabolismo cellulare minimo
- entro i limiti è possibile avere tassi di crescita ≠ variando il tasso di diluizione
- se la concentrazione del nutriente nel mezzo viene aumentata ad un tasso di diluizione costante la densità cellulare aumenta ma non il tasso di crescita che rimane costante
TERRENI DI COLTURA
(1)
- sono soluzioni di nutrienti usati per far crescere i microrganismi in laboratorio
- due classi:
- chimicamente definiti: esatta composizione chimica, usati principalmente quando si ha già una popolazione specifica
- chimicamente non definiti: miscele complesse di composti di cui non è nota l'esatta composizione chimica, solitamente sono misti di estratti proteici, lieviti, fosforo, azoto etc.etc., perchè terreni ricchi con ≠ fonti permettono lo sviluppo di ≠ popolazioni sconosciute e ce ne crescono di tutti i tipi perchè soddisfano abbastanza le varie esigenze microbiche
(2)
≠ tipologie:
terreni arricchiti-complessi
- crescita più veloce perchè addizionati di molecole complesse come vitamine, aa, basi azotate ricavate da sangue, plasma, siero, molto usato per microrganismi esigenti
terreno minimo-selettivo
- chimicamente definito con un numero minimo di sostanze indispensabili per la crescita di una specie microbica possono essere:
- senza fonti di C: microrganismi autotrofi
- con un unica sostanza organica: selezione eterotrofi con specifiche capacità
- con sali biliari
terreni differenziali
- per identificare popolazioni mettendone in evidenza delle caratteristiche specifiche morfologicamente e fisiologicamente
- terreno xgluc.: specifico per E.coli, selettivo per i sali biliari i quali sono tossici per i gram +, oltre ad avere un substrato che ne permette la colorazione: xgluc viene idrolizzato con enzima ß-glucorossidasi che da luogo ad una colorazione blu-verde, quindi il composto idrolizzato dimezza in uno verde
terreni solidi
- contengono una sostanza gelificante, molto usati per la coltivazione di microrganismi in laboratorio
- Agar: polimero di D-galattosio L-galattorio e acido D-glucoronico estratto dalle alghe rosse
- mantiene il terreno liqudo a T>40-45°C , e forma un gel solido a T <
- dopo la solidificazione il gel rimane solido anche aT > 45°C (circa fino a 80°C)
- tre tipologie di semina:
- semina per spatolamento: campione depositato con pipetta su superficie della piastra, quindi viene distribuito uniformemente sulla superficie con un asta sterile di vetro, dopo l'incubazione ottengo colonie superficiali
- semina per inclusione: il campione viene depositato su una piastra sterile e successivamente viene aggiunto il terreno e mescolato, dopo l'incubazione ottengo colonie incluse nel terreno
- semina per striscio: tipica piastra con distribuzione ordinata secondo alla sua applicazione sul terreno
(3)
colonie
- pura: gruppo di clonale di cellule, in quanto progenie di un unica cellula seminata o intrappolata nel terreno
- i terreni solidi permettono di isolare colture pure
- colture possono non sembrare pure ed esserlo e viceversa
- ls morfologia della colonia dipende dalla specie batterica, dal terreno di coltura, dalle condizioni di crescita
- se ci sono più morfologie solitamente coltura non pura
- si distunguono per forma, spessore, margine e colore
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FATTORI DI CRESCITA
(1)
- composto organico necessario alla crescita che il microrganismo non sintetizza autonomamente: aa, vitamine, basi azotate
- prototrofi: microrganismi capaci di sintetizzare tutte le molecole organiche di cui necessitano partendo da un unica fonte di carbonio
- auxotrofi: microrganismi che non sono in grado di sintetizzare alcune delle molecole organiche essenziali e richiedono queste come fattori di crescitaa
- biotina e vitamine B1 (tiamina), B6 (piridossina) e B12 (cobalamina) sono le vitamine più comunemente richieste dai ≠ microrganismi
- i batteri prototrofi possono divenire auxotrofi a causa di mutazioni che inattivano uno o + geni necessari per la biosintesi di specifici fatturi di crescita
(2)
trasporto
- funzione di barriera del doppio strato fosfolipidico essenziale per evitare un entrata e uscita incontrollata di molecole
- la memrbana è quindi selettivamente permeabile
e deve possedere due caratteristiche:
- velocità di trasporto: poche sostanze con molecole piccole e polari o poco polari sono in grado di diffondere rapidamente transmemrbana
- direzionali per trasporto netto secondo gradiente, altrimenti uso di energia
diffusione facilitata
- diffusione avviene con direzione e velocità proporzionale alla concentrazione
- proteine integrali di memrbana permettono di incrementare di molto la velocità del flusso
- Porine: canali che facilitano il passaggio, come acquaporine
- permeasi: legano specificamente una molecola e la spostano da un lato ad un altro della membrana (uniporto)
trasporto attivo
- sfrutta energia metabolica per trasferire soluto contro gradiente
- trasporto primario: passaggio soluto direttamente accoppiato a passaggio di energia
- trasporto secondario: la cellula usa energia potenziale di un gradiente elettrochimico per trasporto transmemebrana
- simporto, antiporto
trasporto ABC
tre componenti:
- proteina associata a memrbana citoplasmatiche che lega e idrolizza ATP
- proteina integrale di memrbana funge da canale
- proteina preiplasmatica nei gram - o di superficie nei gram + ad alta affinità
- identificati 200 tipi di questi trasportatori
traslazione di gruppo
- la molecola attraversa la memrbaan contemporaneamente viene modificata chimicamente
- intervento di più pp a localizzazione citosolica
- esempio le fosfotransferasi PTS che presiedono il trasporto di zuccheri come glucosio, mannosio e fruttosio
- molto studiato in E.coli:
- quattro pp citoplasmatiche El, Ella, Ella, HPr e Ellc proteina di memrana
- meccanismo ciclico in cui PEP fosforila El, il quale fosforila HPr. che fosforila Ella che fosforila Ella, il quale riconosce lo zucchero e lo trasporta intracelllularmente fosforilandolo
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