(1)
fase lag

• quando coltura microbica viene inoculata in un nuovo mezzo di coltura la crescita inizia solo dopo un periodo di tempo chiamato fase di latenza
• se una coltura in crescita esponenziale viene trasferita nello stesso mezzo alle stesse condizioni di crescita (temperatura, areazione etc.) non vi sarà sostanzialmente alcun ritardo e la crescita esponenziale inizierà immediatamente
• per crescere in qualsiasi terreno di coltura le cellule devono avere gli enzimi necessari per la sintesi dei metaboliti essenziali non presenti in quel mezzo
• quindi, se le cellule vengono trasferite in un terreno minimo, i metaboliti essenziali devono essere biosintetizzati ed è necessario il tempo per la sintesi dei nuovi enzimi richiesti per produrre un piccolo pool di ciascun metabolita

(2)
crescita esponenziale

• durante la crescita esponenziale la popolazione cellulare raddoppia a intervalli regolari per un periodo breve esteso a seconda delle risorse disponibili e di altri fattori
• le cellule di fase esponenziale sono in genere nel loro stato più sano e sono quindi più desiderabili per gli studi dei loro enzimi ed altri componenti cellulari
• in generale i procarioti credono più velocemente microrganismi eucarioti e piccoli eucarioti tendono a crescere più velocemente di quelli grandi
• in questa fase non vi sono alte concentrazioni di metaboliti secondari, quindi organismi sono sani e attivi
  

(3)
fase stazionaria

• la crescita diventa limitata perchè o una sostanza nutritiva essenziale nel mezzo in coltura è esaurita o i prodotti di scarto dell'organismo si accumulano
• quando la crescita esponenziale cesso per uno o entrambi i motivi la popolazione entra in fase stazionaria
• nonstante l'arresto della crescita il metabolismo energetico e i processi biosintetici nelle cellule possono continuare, ma normalmente ad. una velocità ridotta
• alcune cellule possono dividersi in fase stazionaria ma ciò non provoca l'aumento netto di popolazione delle cellule in quanto altre muoiono
  => crescita criptica in cui i due processi si bilanciano
• successivamente la popolazione entrerà in fase di morte
  

(4)
crescita diauxica

• due distinte fasi di crescita separate da una fase di stasi
• in presenza di due fonti di carbonio, si ha un uso preferenziale di una sola delle due
• nel caso di esaurimento di glucosio E.coli entra in fase lug e riprende successivamente la sua crescita con consumo di lattosio => si riprogramma

(5)
chemostato

• dispositivo di coltura continua, sistema chiuso in cui un volume noto di terreno fresco viene aggiungo ad una velocità costante mentre un volume uguale di terreno di coltura esaurito viene rimosso alla stessa velocità
• dispositivo in cui sia tasso di crescita (quanto velocemente le cellule si dividono) sia densità cellulare possono essere controllate indipendentemente
• due fattori governano la velocità e la densità:
  
  • il tasso di diluizione: velocità alla quale viene pompato il medium fresco e il medium esaurito viene rimosso
  • concentrazione di un nutriente limitante
• ad un tasso di diluizione alto l'organismo non cresce abbastanza velocemente rispetto alla sua diluizione quindi viene eliminato
• ad un tasso di diluizione basso le cellule possono morire perchè il nutriente limitante non viene aggiunto abbastanza velocemente da supportare il metabolismo cellulare minimo
• entro i limiti è possibile avere tassi di crescita ≠ variando il tasso di diluizione
• se la concentrazione del nutriente nel mezzo viene aumentata ad un tasso di diluizione costante la densità cellulare aumenta ma non il tasso di crescita che rimane costante
  

(1)

• sono soluzioni di nutrienti usati per far crescere i microrganismi in laboratorio
• due classi:
  
  • chimicamente definiti: esatta composizione chimica, usati principalmente quando si ha già una popolazione specifica
  • chimicamente non definiti: miscele complesse di composti di cui non è nota l'esatta composizione chimica, solitamente sono misti di estratti proteici, lieviti, fosforo, azoto etc.etc., perchè terreni ricchi con ≠ fonti permettono lo sviluppo di ≠ popolazioni sconosciute e ce ne crescono di tutti i tipi perchè soddisfano abbastanza le varie esigenze microbiche

terreni arricchiti-complessi

• crescita più veloce perchè addizionati di molecole complesse come vitamine, aa, basi azotate ricavate da sangue, plasma, siero, molto usato per microrganismi esigenti
  

terreno minimo-selettivo

• chimicamente definito con un numero minimo di sostanze indispensabili per la crescita di una specie microbica possono essere:
  
  • senza fonti di C: microrganismi autotrofi
  • con un unica sostanza organica: selezione eterotrofi con specifiche capacità
  • con sali biliari

terreni differenziali

• per identificare popolazioni mettendone in evidenza delle caratteristiche specifiche morfologicamente e fisiologicamente
• terreno xgluc.: specifico per E.coli, selettivo per i sali biliari i quali sono tossici per i gram +, oltre ad avere un substrato che ne permette la colorazione: xgluc viene idrolizzato con enzima ß-glucorossidasi che da luogo ad una colorazione blu-verde, quindi il composto idrolizzato dimezza in uno verde

terreni solidi

• contengono una sostanza gelificante, molto usati per la coltivazione di microrganismi in laboratorio
• Agar: polimero di D-galattosio L-galattorio e acido D-glucoronico estratto dalle alghe rosse
• mantiene il terreno liqudo a T>40-45°C , e forma un gel solido a T <
• dopo la solidificazione il gel rimane solido anche aT > 45°C (circa fino a 80°C)
• tre tipologie di semina:
  
  • semina per spatolamento: campione depositato con pipetta su superficie della piastra, quindi viene distribuito uniformemente sulla superficie con un asta sterile di vetro, dopo l'incubazione ottengo colonie superficiali
  • semina per inclusione: il campione viene depositato su una piastra sterile e successivamente viene aggiunto il terreno e mescolato, dopo l'incubazione ottengo colonie incluse nel terreno
  • semina per striscio: tipica piastra con distribuzione ordinata secondo alla sua applicazione sul terreno

(3)
colonie

• pura: gruppo di clonale di cellule, in quanto progenie di un unica cellula seminata o intrappolata nel terreno
• i terreni solidi permettono di isolare colture pure
• colture possono non sembrare pure ed esserlo e viceversa
• ls morfologia della colonia dipende dalla specie batterica, dal terreno di coltura, dalle condizioni di crescita
• se ci sono più morfologie solitamente coltura non pura
• si distunguono per forma, spessore, margine e colore

(1)
conta al microscopio

• conta al microscopio ottico per definire la crescita di colonia, sebbene sia una tecnica con ≠ limitazioni:
  
  • le cellule morte non si distinguono dalle vive
  • piccole cellule non si notano
  • si possono confondere le cellule con il fondo
  • non sempre i microrganismi sono distaccati e quindi distinguibili
  • possono esserci particelle in sospensione che possono essere scambiate per microrganismi
• rimedio usando tecniche di colorazione per distinzione cellule vive e morte
  => conta al microscopio nonostante le limitazioni ha un elevata percentuale di precisione ed è utile anche con colonie di molti organismi in quanto essa viene diluita per la conta
• uso vetrini con camere quadrate per la conta, e per il calcolo c'è una formula specifica (cerca)

(2)
conta vitale

• altra tecnica che si basa sulla crescita delle colonie su terreno rigido, in quanto ogni colonia deriva da un singolo individuo clonato (quindi conto il microbo iniziale che ho seminato)
• il numero di colonie può variare a seconda della durata dell'incubazione
• l'uso di terreni di coltura altamente selettivi e condizioni di crescita consentono di usare il conteggio delle placche per individuare specie particolari in un campione di ≠ organismi
  -semina per inclusione o superficiale, in entrambi i casi per la conta deve verificarsi una diluizione: diluisco in multipli. di 10 e la conta va effettuata sulle diverse diluizioni per un margine minore di errore
• i limiti sono comuni alla conta al microscopio, inoltre se gli individui vengon seminati vicini posso avere colonie non distinguibili
  => uso UFC: unità di forma di colonia, ossia unità di misura che considerano il margine di errore della conta vitale, in quanto conto il # di colonie in una determinata diluizione e lo moltiplico per il fattore di diluizione, oppure faccio una media dei UFC delle varie diluizioni ed ottengo una media
• i valori saranno sempre leggermente storpiati per "the Great late anomala":
  
  • i conteggi di cellule totali sono una sottostima dei numeri di cellula reali effettivi da uno a ≠ ordini di grandezza
  • ≠ organismi possono avere requisiti ≠ per nutrizione e condizioni di crescita nella cultura in laboratorio
  • un terreno e un insieme di condizioni di crescita sostegno la crescita stessa si un solo sottogruppo della comunità microbica
    totale

(3)
spettrofotometria

• solo in laboratorio, misuro la torbidi per definire una massa di celllule
• per organismi unicellulari, la densità è proporzionale entro certi limiti al # di cellule
• un alta densità cellulari la luce che fuoriesce dalla fotocellula di una cella può essere ≠ dalla luce emanata da una seconda fotocellula, inoltre la corrispondenza # di cellule e torbidi è meno accurata
• organismi ≠ di ≠ dimensioni e forme con lo stesso numero di cellule non è detto che necessitino della stesso valore di assonanza

(1)
controllo mediante calore

• tutti i microorganismi possono essere uccisi al di sopra di una determinata temperatura soglia
• la stessa crescita microbica può essere rallentata (in rari casi acellerata), in quanto il calore modifica i processi chimici
• anche il tempo di incubazione ad una certa temperatura può arrivare ad uccidere il 90% dei batteri
• alcuni organismi riescono ad alzare la propria T soglia
• la resistenza al calore è differente fra cellula vegetativa ed endospora, e solitamente le endospore hanno una resistenza molto maggiore sia per la durata che per la T stessa
• tempo e T quindi dipendono dall'organismo , e a parita di T il tempo è indipendente dal numero di cellule
• autoclave:
  
  • strumento di sterilizzazione con calore umido (+ efficace)
  • sigillato ed usato sia per sostanze liquide sia solide
  • per uccidere le endospore con il calore è richiesta la temperatura superiore all'ebollizione dell'acqua e una pressione di 1 atm
    
    • aumentando la pressione anche la temperatura si innalza, e ciò permette allo strumento di ridurre i tempi di resistenza anche delle endospore (a 15 min)
• • è grande l'autoclave maggiore è il tempo di raggiugimento della T desiderata
    
    • autoclave da laboratorio e industriali sono sottopressione e hanno entrata di vapore dall'esterno
• altri possibili strumenti solo stufe, in cui T e pressione sono minori ma la durata è lunga

(2)
radiazioni

• prevalentemente per la sterilizzazione di materiali solidi
• uso principalente di raggi UV e radiazioni ionizzanti
• gli UV hanno scarsa penetrazione, quindi adatti per superfici di cappe e purificazione dell'aria
• le radiazioni ionizzanti (raggi gamma) sono molto penetranti
• usato per articoli sterili monouso in materiale plastico non termoresistiente come siringhe , provette, etc.
• usato anche per soluzioni acquosa termosensibili

(3)
filtrazione

• sterilizzazione utilizzato per sterilizzare soluzioni acquose sostanze termolabili come vitamine, antibiotici farmaci o estratti cellulari che sarebbero inattivate e denaturate da trattamenti termici
• uso di una memrbana filtrante attraverso cui è fatta passare la soluzione mediante l'aspirazione con una pompa da vuoto o mediante pressione
• le membrane filtranti sono sottili memrbane di nitrocellulosa, polipropilene o polisulfone con pori di diametro max di 0,4 o 0,2 micrometri
• usato anche per purificare aria e gas (cappa)