生物製劑
蛋白質製劑

生物製劑與小分子藥物的異同

蛋白質

蛋白質生物製劑開發 BY Mass

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  1. 製造- 生物細胞製造；化學合成
  2. 分子量- 上千/上萬Dalton；上百Dalton
  3. 物化性質- 複雜多樣；單純單一
  4. 分析確效- 純度難測定；純度易測定
  5. 免疫反應- 可能性高；可能性低
  6. 投藥方式- IV為主；各種劑型都有
  7. 保存- 低溫；常溫
  8. 生物性雜質- 可能性高；可能性低

口訣(生物製劑)- 茱蒂砸大蛋
(注射低溫複雜大分子量蛋白質)

生物相似藥法規

歐盟的EMEA，有

  1. 相似生技藥similar biological product
  2. Bio-similar

美國的USFDA，有

  1. 歷史因素的生技藥品，像是早期從動物取下的胰島素、生長激素、性腺激素等；依照食品、藥物與化妝品管理法(FD&C Art)管理，並依循新藥申請流程(NDA)
  2. 非歷史因素的生技藥品，像是EPO、干擾素、抗體等；
    依照公共健康服務法(PHS Act)管理，並依循生物產品許可申請(BLA)

尋找生物標記

  1. 蛋白質分子量分析，區分單體、二倍體、三倍體；應用於重組蛋白純度
  2. 蛋白質身分鑑定(Protein ID)
  3. 副產物(side product)、不純物(impurity)分析
  4. 胺基酸單點置換
  5. 全序列鑑定分析，實驗室要求5-20%覆蓋率，而業界要求100%覆蓋率
    ；影響因素- 蛋白質序列與結構已知與否(重組已知，一般未知)、合適酵素、Mass偵測範圍、蛋白質四級結構且分子量大
  1. 蛋白質轉譯後修飾(PTM)，像是磷酸化(phosphorylation)、醣基化(glycosylation)、氧化(oxidation)、雙硫鍵(disulfide bond)

Mass用途

  1. 尋找生物標記
  2. 鑑定重組/純化蛋白質產品的QC，像是對比性試驗(comparability test)，鑑定市售與新藥的相似度，或是同工廠不同批次的相似度
  1. 選擇clone，像是倉鼠卵巢細胞(CHO cell；高轉染且好繁殖)，須小心非人類醣基化
  2. 細胞培養
  3. 動物試驗
  4. 人體試驗

產品QC

clone種類

  1. 單細胞生物，有細菌(質體)與酵母菌
  2. 多細胞生物，有果蠅(高繁殖力且只有4對染色體)、蚊蠅(中間宿主)、斑馬魚(胚胎發育)、基因轉殖鼠
  3. 病毒載體(高轉染/高專一/簡單基因)，有DNA病毒、RNA病毒、反轉錄病毒

細胞與酵母菌的異同

  1. 都是單細胞
  2. 單倍體；單倍體/雙倍體
  3. 基因數=4,000；6,000
  4. 生長速度，每20min分裂一次；每90min分裂一次
  5. 培養濃度=十億(9個十)cells/ml；十億(9個十)cells/ml
  6. 保存，都是低溫
  7. 環境，可以忍受高溫；不能忍受高溫
  8. 備註，有安全上的疑慮，像是LPS；較其他真核更容易重組
  1. 備註: DNA是雙股螺旋，10個鹼基為一個螺旋
  2. 備註: AT配對之間是雙鍵，鍵能較低而容易打開；CG配對之間是三鍵，鍵能較高而較不容易打開
  3. 備註: 植物病毒的花費最低且蛋白產量最高

基因轉殖
(DNA放大 BY PCR)
(前處理、轉錄與轉譯)
(蛋白質檢驗 BY 西方墨點法)

前處理

DNA純化

DNA Melting

  1. 細胞溶解，釋出DNA、RNA與蛋白質
  2. 加入試劑phenol，溶解蛋白質，剩下DNA與RNA不溶
  3. 加入酵素ribonuclease，分解RNA，剩下DNA不溶
  4. 加入酒精後離心，促使DNA沉澱在溶液下層

透過加熱到Tm(melting temperature，能使50%DNA解螺旋的溫度)，破壞螺旋的氫鍵，而使DNA解旋，而AT配對會先解螺旋，再來是CG配對會解螺旋

  1. 備註: 原核生物有操縱子operon，但是只有一個調控區而沒有基因間區，代表同一基因被轉錄出來的mRNA較為多樣性
  2. 備註: 真核生物有操縱子operon，並在每一基因前都有一個調控區與基因間區，代表同一基因被轉錄出來的mRNA只有一種

轉錄

真核生物的核醣體，是40S與60S次單元組成
原核生物的核醣體，是30S與50S次單元組成

遺傳密碼 genetic code

轉譯

  1. initiation BY tRNA
  2. elongation
  3. termination BY UAA/UGA/UAG
    備註: N端是NH2；C端是COOH

PCR

三步驟

四要素

  1. DNA模板
  2. 引子
  3. DNA polymerase
  4. 四種核甘酸 + 緩衝液
  1. 變性denaturation/94-96℃，雙股變單股，當作模板
  2. 引子黏合annealing of primers/55-72℃，加入引子
  3. 核酸延長extension of primers/68-72℃，加入DNA polymerase、(四種核甘酸 + 緩衝液)

Western blotting

偵測細胞、組織或體液中特定蛋白質的表現

  1. 蛋白質萃取與製備
  2. 膠體電泳gel electrophoresis，使用SDS-PAGE膠體(使蛋白變性並帶負電)；
    大分子量蛋白，游離速度較慢，而小分子量蛋白，游離速度較快
  3. 轉漬transfer，將蛋白質轉漬到PVDF/NC材質的模上
  4. blocking，用其他種類蛋白質填滿轉漬模上的孔洞
  5. antibody probing，使蛋白質接上primary antibody，形成抗原-抗體複合體
  6. detection，在primary antibody接上secondary antibody OR 螢光物質，來放大訊號
  7. imaging & analysis

胺基酸

胜肽

抗體

  1. 中心Cɑ，接上氨基/羧基/H/R-Group
  2. 依照R-Group的物化性質，又可以分成非極性、極性、酸性、鹼性
  3. 天然胺基酸都是L-form
  4. 大部分胺基酸是鏡像異構物；除了glycine
  5. 胺基酸的酸性或鹼性，要依照環境而定= 兩性
  1. 非極性胺基酸: alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine
  2. 極性胺基酸: serine, threonine, cysteine(形成雙硫鍵), methionine
  3. 酸性胺基酸: tyrosine, phenylalanine, tryptophan, aspartate, asparagine, glutamate, glutamine
  4. 鹼性胺基酸: lysine, arginine, histidine
  5. 環形胺基酸: proline(在三級結構中，形成轉折處)
  1. 等電點PI，在某一PH下，同時帶正電與負電，使淨電荷為零
  2. 等電點公式= pI = [兩個pKa的胺基酸] (pK1+pK2)/2 = [含有三個以上pKa的胺基酸] 取pI前後的兩個pKa/2

兩個胺基酸形成的肽鍵，具有雙鍵性質，使周邊六個原子都在同一平面(C-N鍵都是sp2軌域鍵結)、前後Cɑ的C-N鍵呈現trans-form

  1. 一級結構: 長鏈胺基酸序列，同一條胜肽鏈
    。
  2. 二級結構: 長鏈胺基酸序列，同一條胜肽鏈，並由氫鍵摺疊；
    像是，ɑ-helix & ß-sheet
    。
  3. 三級結構: 長鏈胺基酸序列，同一條胜肽鏈，並由氫鍵、離子鍵、疏水作用摺疊；cysteine形成共價鍵 & proline助於三級結構形成
    。
  4. 四級結構: 長鏈胺基酸序列，多條胜肽鏈；像是，分成球狀蛋白與纖維蛋白
    球狀蛋白，水溶性且不穩定，像是大部分酵素、血紅素
    纖維狀蛋白，非水溶且穩定，像是結構蛋白、角蛋白

胺基酸序列定位法 BY

  1. 直接胺基酸定序法
  2. cDNA定序法
  1. 蛋白質變性: 受pH、濃度、溫度影響，而破壞鍵結，常見於萃取
  2. 蛋白質復性: 在變性後可以復原，像是RNase A

蛋白質折疊，有時需要Chaperone proteine(chaperonin)才能折疊

重組DNA技術

  1. 限制酶切開質體
  2. 接上目標基因
  3. 重組質體
  4. 基因表現
  1. 重組DNA: 酵母菌、細菌
  2. 單株抗體: 動物細胞

蛋白質降解

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蛋白質純化

如何拿到細胞內的蛋白質

純化初期

  1. French press (剪切力)
  2. Sonication (超音波)
  3. Enzymetic/Chemical lysis (細胞膜打洞)

純化中期

蛋白質降解常見途徑

防止蛋白質降解方法

1) Ubiquitin-proteasome pathway(分解lysine)　2) lysomal proteolysis

1) PMSF (protease inhibitor)　2) 其他protease inhibitor　3) 提高/降低pH

  1. 鹽析(salting-out，非極性端增加而析出) & 鹽溶(salting-in，環境極性增加而溶解) BY 硫酸銨(高溶解度/調控pH/減少變性)
  2. 有機溶劑沉澱(降低介電常數，使蛋白質溶解度降低)

層析分離

  1. 膠體過濾gel filtration(GF) = partition filtration: 依分子量大小分離；大蛋白，跑得快，而小蛋白，跑得慢
    膠體粒徑越粗，流速越快，而膠體粒徑越細，流速越慢
    細膠體粒徑的解析力較好，而粗膠體粒徑的解析力較差
  2. 離子交換ion exchange(IEX): 依帶電性正負以及強弱分離；背景酸鹼值，高於pI則帶負電，低於pI則帶正電
    同電荷高電量，強於同電荷低電量，而同電量大原子序，強於同電量小原子序
    高濃度氫離子，強於低濃度其他陽離子
  3. 疏水層析hydrophobic interaction chromatography(HIC): 依蛋白質疏水程度，與非極性固定相結合強弱不一，
    像是Octyl-Sepharose的非極性高於Phenyl的非極性
  4. 親和層析affinity(AC): 依蛋白質的親和性分離，像是抗體與抗原、Ni金屬與histidine
  1. AC OR IMAC，capture特定蛋白質；IEX用在各階段；GF用於最後polishing
  2. UV，知道有蛋白
  3. 降解蛋白質 & 用Mass來分析成分
  4. X-ray，知道晶型結構
  1. 固定區，決定抗體的isotype，含有重鏈；變異區，由重鏈與輕鏈組成；超變異區，在輕鏈與重鏈各有三處；抗體中心的雙硫鍵，降低抗體的立體阻礙
  2. 抗原呈現細胞上的抗原，有抗原決定位(Epitope, antigenic determinant)；由6個以上的胺基酸組成；每一個抗原決定位，至少能胜成一種專一性抗體
  3. 抗體辨識位，則沒有像抗原決定位這麼專一性，只要構型符合即能接上，也就是每一個抗原決定位，決定B細胞的抗體種類且每B細胞只能對一種決定位生產一種抗體，反觀，抗體辨識位，只要允許就能都被接上
  4. 中樞淋巴器官，會有receptor editting(淋巴球辨識外來抗原，而非內生抗原)、clonal deletion(會攻擊自身B/T細胞的淋巴球，會被動地進行細胞凋亡)
  5. 周邊淋巴器官，會有clonal deletion、clonal inactivation(淋巴球無法產生抗體)、clonal suppression(調節T細胞抑制淋巴球活性)
  6. 免疫反應種類: 初級免疫反應(先產生IgM再產生IgG)；次級免疫反應(IgG > IgM)

抗體isotype

  1. Fab，只能辨識抗原，但無法與補體、巨噬細胞結合
  2. IgG，4重鏈(Vʏ)與2輕鏈(Cĸ OR Cλ)組成，為血液中最多的抗體，且能夠通過胎盤，賦予胎兒免疫能力
  3. IgM，(Vµ)+(Cĸ OR Cλ)，五倍體，具有活化補體的最好能力，主要分布於血液
  4. IgA，(Vɑ)+(Cĸ OR Cλ)，二倍體，主要分布於消化道、分泌物(乳汁、唾液)
  5. IgE，(Vɛ)+(Cĸ OR Cλ)，5重鏈組成，可與肥大細胞結合，引發過敏反應，主要分布於皮膚/呼吸道黏膜
  6. IgD，(Vδ)+(Cĸ OR Cλ)

抗體製備

  1. 抗XX血清- 1st 給小鼠打入抗原 2nd 從脾臟等淋巴器官取得多種B細胞，並從中取得多株抗體(多種抗體) 3rd 純化多株抗體，留下想要的抗體種類
  2. 單株抗體- 1st 同上 2nd 同上 3rd 將取出來的B細胞與癌細胞(myeloma)融合，並將融合成功後的融合瘤細胞進行單株化(cloning)，從中取得單株抗體
  3. 打入小鼠體內的抗原製劑中的佐劑功能- 1) 刺激免疫 2) 暴露epitope 3) 緩釋抗原 4) 幫助抗原溶解
  4. 確定B細胞的抗體種類所需的技術- ELISA (屬於一種EIA，enzyme immunoassay)，跟西方墨點法的detection很像，只是差異在於ELISA是用抗原當作固定相，接上抗體
  5. 如何確定細胞融合成功所需的技術- HAT medium；
    1st 加入aminoterin，阻斷葉酸循環
    2nd 加入hypoxanthine, thymidine，讓具有HGPRT & TK酵素的細胞存活，可以合成DNA，因此，留下細胞瘤細胞，而非癌細胞
    備註: 細胞融合，利用PEG將B細胞語癌細胞融合，形成可永生的細胞瘤細胞
  6. 如何加快單株化過程所需的技術- FACS，fluorescence-activated cell sorting，略過單株化，將融合瘤細胞直接蒐集起來，也就是流式細胞技術(single cell sorting)

抗體製備的基因表現

  1. Ig的基因座有 (V變異區)40種 + (J接合區)5種 + (C固定區)1種
  2. B細胞分化時隨機決定 (V)C40取5 + (J)C5取3 + (C)C1取1
  3. 透過RNA Splicing，切除多餘的基因，做出不同isotype的抗體
  4. 最後，轉錄成mRNA，再經由核糖體轉譯

產生10的12次方種抗體的因素:

  1. V區與J區的排列組合
  2. J區的不精確
  3. 體細胞超突變(=超變異區點突變)，常發生於CG配對豐富的V區基因，受到AID酵素影響，促使單一點突變，將C deamination成U，而身體必須修補，才能恢復成原來的CG配對，或是修復成T，來增加AT配對
  4. class switch，藉由RNA Splicing，形成不同種isotype；主要針對於C固定區，來產生Cɑ(轉錄成IgM)與Cµ(轉錄成IgA)

重組抗體的基因工程

重組抗體

  1. mouse antibody，全老鼠；施打頻率最高，同時重複施打所引起的過敏反應最強，因為抗原性最強
  2. chimeric antibody (1984)，(V區)老鼠+(J區&C區)人類
  3. humanized antibody (1986)，(超變異區)老鼠+(其他V區&J區&C區)人類
  4. human antibody (2012)，全人類；施打頻率最低，同時重複施打所引起的過敏反應最弱

重組抗體命名原則

  1. mouse抗體 -momab，像是muromomab
  2. chimeric抗體 -ximab，像是rituximab
  3. humanized抗體 -xizumab(老鼠較多)&-zumab(人類較多)，像是otelixizumab & lemtuzumab
  4. human抗體 -mumab，像是adalimumab

重組抗體的製備方法

  1. 傳統方法，打入抗原到老鼠體內，由脾臟細胞抽取B細胞，並與癌細胞融合(9W)，做成hybridoma(1W)，最後單株化需要2W，
    總共需要3個月；備註- 使用基因轉殖鼠(Kirin mouse)，能夠直接拿到human抗體
  2. phase display，打入抗原到老鼠體內，由脾臟細胞抽取B細胞，將抗體的mRNA定序成cDNA，再使用AID試劑引發超變異區點突變，形成FvDNA(轉錄&轉譯成只有V區的抗體)，最後，放入噬菌體(phagemid，噬菌體與質體的克隆載體)體內，來感染大腸桿菌，產生抗體
    應用於製作大自然不存在的抗體、快篩試劑(coating在Elisa plate上，用抗體找抗原，像是SARS、MERS等已知抗體資料庫的病毒)
  3. B-cell based method，打入抗原到老鼠體內，由脾臟細胞抽取B細胞，使用FACS取出特定細胞，再用RT-PCR將mRNA反轉錄成重鏈基因與輕鏈基因後，使用PCR放大，最後，放入噬菌體(phagemid，噬菌體與質體的克隆載體)體內，來感染大腸桿菌，產生抗體
  4. enzyme cleavage，將抗體用酶水解成只剩V區的抗體，像是F(ab)2 (使用pepsin digest，產生完整V區 + 1*雙硫鍵)、Fab (使用papain digest，產生單一V區)