(1)

• se estraggo DNA di una coltura pura, i frammenti sono di un unico organismo, se estraggo da una comunità ho DNA mischiato di più organismi
• nel momento in cui faccio PCR in entrambi i casi uso dei primer che sono specifici di un batterio, quindi ottengo tanti frammenti tutti uguali per lunghezza e sequenza di basi (sia nella pura che nella comunità)
• se amplifico con primer conservati per più organismi ottengo per PCR dei frammenti che sono più o meno lunghi uguali, ma con sequenze diverse per i vari organismi (nella comunità)
• la procedura per comunità o coltura pura è uguale nelle prime fasi (posso usare anche stessi primer nella PCR), ma la differenza è nel prodotto dell'analisi: con comunità ho più sequenze
• fondamentale per la tecnica di sequenziamento che devo usare, perchè questi segmenti ≠ saranno tutti mischiati in una provetta, quindi devo sequenziarli in maniera diversa per ottenere le informazioni necessarie

(2)

• tecnica di sequenziamento Sanger: tecnica classica, il cui requisito è che nella provetta devo avere frammenti di DNA tutti con la stessa sequenza, in quanto si basa sul fatto che devo avere multiple copie nella provetta perchè si mette un solo primer che è complementare alla sequenza da sequenziare, e oltre agli ingredienti necessari per la PCR inserisco due tipi di nucleotidi: normal dNTP e nucleotidi modificati che mancano del gruppo OH in posizione 3', e il gruppo OH è necessario per creare la catena, quindi se viene incorporata una base che manca dell'OH non continua la polimerizzazione
  => nel mix della PCR c'è una certa proporzione di questi due tipi di nucleotidi, quindi nel momento dell'amplificazione ottengo successivamente il primer ho delle copie di diverse lunghezze in base a dove si è inserito il nucleotide modificato quindi con elettroforesi o altre tecniche posso sapere a quale posizione è la base G, o A, o T etc.etc. quindi ottengo un sequenziameto per ciascuna delle basi modificate
• nei nuovi seqeunziatori Sanger il sequenziamento è contemporaneo e nucleotidi terminali vengono marcati con un fluoroforo, quindi sono già marcati in maniera diversa in base all'ultima base incorporata, quindi con elettroforesi capillare ottengo un alettroferogramma con un picco liuminoso in base alla base terminale
• se ci sono frammenti diversi ho picchi sulla stessa base diversi, quindi se voglio analizzare una coltura pura posso usare la Sanger, ma con comunità, quindi frammenti diversi, non è possibile perchè ottengo un sequenziamento sporco in cui nella stessa posizione ho più picchi (quindi no sequenza)

(3)

• per la comunità quindi devo avere delle tecniche di separazione di frammenti con stessa lunghezza ma sequenze differenti, in quanto anche con Sanger non posso sequenziarli:
  
  • fino a 15 anni fa si prendeva l'amplificato (stessa lunghezza ci impedisce di separare i frammenti per via elettroforetica), con tecnica di trasformazione
  • con vettore inserisco il frammento da clonare nella provetta con tutti i frammenti, quindi ottengo dei plastidi ricombinanti
  • trasformo dei batteri (E.coli) con plasmide ricombinante, uno solo per cellula, quindi riesco a separare un frammento da un altro
  • faccio crescere l'ospite separatamente dalle altre, quindi ciascuna avrà un frammento ≠ ed ottengo colonie tutte con quel frammento
  • problema di questa tecnica consiste per l'analisi microbiologica è che ottengo migliaia di specie microbiche, quindi l'analisi per dare informazioni complete deve essere in grado di fornire migliaia di cloni differenti, quindi grosso problema applicativo ed economico (se ho popolazioni rare devo pure fare più amplificazioni)
    => analisi non era in grado di dare un informazione completa della diversità microbica perchè descriveva solo le più abbondanti della coltura

(1)

• gene marcatore è quello 16S RNA
  procedura sperimentale-passaggi operativi con sequenziamento gene:
• estraggo DNA dal campione ambientale:
  
  • estraggo DNA degli organismi di un campione, in maniera indistinta in quanto non riconosco gli organismi
  • uso metodi diretti con lisi cellulare della memrbana e pareti su cellule che sono ancora nella matrice ambientale, hanno una resa maggiore perchè lisi di tutti gli organismi, ma anche i contaminanti
  • uso metodi indiretti che distaccano le cellule, ma la resa minore perchè non posso staccarle tutte, anche se così non abbiamo più sostanze inquinanti
    
    • ad oggi si usano maggiormente i metodi diretti
• amplificazione per PCR di un frammento del gene 16S RNA, e usando PCR devo usare primer che si appaiano in maniera specifica alle sequenze da analizzare e amplificare, quindi con un DNA misto devo avere dei primer conservati in tutte le sequenze possibili del campione (≠ da analisi di un gene 16S di un organismo singolo)

(1)

• file di sequenze di testo che contengono le informazioni di sequenziamento
• il formato è di 4 righe per ciascuna sequenza:
  
  • prima riga: indicatore alfa-numerico per la singola sequenza
  • seconda riga: sequenza
  • terza riga: +
  • quarta riga: altra stringa alfa-numerica che individua la qualità della sequenza, quindi c'è una corrispondenza fra la prima e quarta riga
• posso avere sequenze fino a 350 basi
• si basa sulle tabelle ASII in cui ci sono corrispondenze fra caratteri alfa-numerici a numeri/simboli, quindi faccio confronto fra basi ed ottengo un numero AS, a cui devo sottrarre 64 = Q (Quality score) = -10logP (probabilità)

(2)
successivamente alla sequenza posso definire la tassonomia, quindi identificare

• due approcci:
  
  • classifico ogni sequenza lavorando per similarità (da range di dominio a specie)
  • raggruppo le sequenze in base alla distanza = UNITA' TASSONOMICHE OPERATIVE OTU
• con il primo metodo ottengo una tabella contenente l'abbondanza di ciascun ordine di ciascun campione, ma ciò porta a molte sequenze non classificate se non fino al livello di ordine
  => metodo più efficiente OTU

alfa-comunità

• contiene due concetti: ricchezza e eveness (distribuzione delle abbondanze)
• ricchezza: ricchezza delle speci, ossia quante diverse specie ho in un determinato ambiente
• eveness: distribuzione dell'abbondanza, se ho tante specie ma ne ho una molto predominante e le altre poco diffuse ho poca eveness, calcolata con indici che possono essere più o meno specifici (ex. Sheldon)
• è necessario esplicare degli indici di ricchezza per vari motivi, esempio
  
  • biomedico:
    
    • infezione batterica (di qualsiasi tipo) che possiede già una propria popolazione microbica con la propria ricchezza e eveness
    • con infezione la ricchezza di specie propria diminuisce per competizione e ancora di più la eveness acambierà sbilanciandosi verso il patogeno, facendo diventare la comunità microbica orginale molto poco even
    • per andamento dell'infezione e del recupero uso questi indici
• ambientale:
  
  • con contaminazione da sostanza tossica, o suolo posso avere drasticamente ridotta la ricchezza ed un aumento della disomogeneità perchè alcune popolazioni vengono positivamente selezionate ed altre negativamente per l'adattamento alla sostanza inquinante
• essendo la diversità microbica così alta, in funzione di quante sequenze produciamo non è detto che si riescano a cogliere tutte le OTU
• grafico curva di rarefazione che da l'andamento del campione:
  
  • x=numero di sequenze ottenute e y=numero OTU,
  • la curva si appiattisce al' ∞ nel momento in cui per ogni sequenza ho una OTU,
  • il piatto corrisponde alla ricchezza vera, ma non avendo un numero ∞ di sequenze la differenza fra la ricchezza osservata e la ricchezza vera può differire di molto
    

beta diversità

• definisco l'andamento di non solo il singolo campione, ma anche posso fare confronto fra comunità microbiche uguali o meno fra due campioni
• analizzo la similarità delle comunità con presenza-assenza delle OTU e anche con abbondanza
• indice di Jaccard:
  
  • date due comunità A e B, di cui sono note le OTU
  • verifico se una delle due è assente o presente e ottengo l'indice
  • indice ha al numeratore il numero di OTU condivise e sotto la somma delle OTU separate e sottratto il numero di OTU comuni
• indice di simililarità di Bray-Curtis sono relativi all'abbondanza
• vi sono anche indicatori che non solo si basano su abbondanza delle OTu ma anche quanto sono simili filogeneticamente:
  
  • le OTU fra di loro: date due comunità microbiche che hanno stessa distanza ß perchè hanno popolazioni ≠ ma in parte sovrapposte, le OTU filogeneticamente si assomigliano molto
  • viceversa se comunità filogeneticamente sono ≠ e uno stesso indicatore beta, le due comunità sono ≠ ma popolazioni uguali allora sono più simili fra loro
  • fanno pesare di più la distanza filogenetica, in quanto se nelle due popolazioni simili la stima della beta diversità diminuisce
    => a livello di comunità se sono più differenti per la filogenetica sono più diverse le stesse comunità

(1)

• numero di sequenze di una popolazione è un'abbondanza relativa in quanto non dice quanto ce ne sia effettivamente, bensì quanto ne sono riuscito a sequenziare
• cio che interessa però è l'abbondanza assoluta, quindi il numero di organismi nell'ambiente/organismi
• varie tecniche per l'abbondanza assoluta:
  
  • FISH
  • quantitative real time PCR

esempio applicativa FISH:

• individuo microrganismi attivi e la domanda scientifica fosse perchè nel nord Irlanda ci fossero alte quantità di microrganismi aerofiti termofili paragonabili ai mesofili, quando la temperatura non ave va mai raggiunto i 25°
• venne scelta la Fish per verificare che non fossero attivi oppure lo fossero nei suoli a temperature ambientali
• quindi si dovevano individuare i microrganismi attivi: in un caso il suolo è stato analizzato in quel modo e in un altro venne aggiunto uno dei terribili della zona, vennero messi in un range di temperatura da 4 a 60 gradi per 15 giorni e vennero usate due sonde ≠, una verde per i batteri non termofili e una ≠ per il termofilo
• nel suolo con termofilo solo una piccola parte mostrava la presenza dei microrganismi attivi se non a 60 gradi, quindi il fatto che fossero così presenti per trasporto esterno
  

• SYBR Green detection: colorante sybr green fluorescente che si vede con DNA a doppio filamento, quindi al termine della fase di estensione della PCR esso si lega ed emette fluorescenza, quindi maggiore è il numero di filamenti legati maggiore è la fosforescenza, rilevata da sensori sul termocliclatore, sonda aspecifica
• amplificazione con sonda specifica:
  
  • il frammento del DNA deve essere uguale alla regione interna da amplificare in modo tale da avere una sonda che si appai al filamento, quindi devo conoscere anche le terminazioni del segmento per i primer, oltre ad un quencher che è una molecola che impedisce la fosforescenza della sonda quando non è legata al filamento
  • nella fase di annealing si appaieranno sia la sonda che la parte centrale e durante la fase di estensione la polimeri rimuove la sonda interna e quindi stacca sonda e quencher che essendo separati ne porteranno la fluorescenza che è proporzionale alle sequenze amplificate nel tempo
• la uso con primer conservati a dominio, primer anche a taxon specifico (classe e genere e specie), quindi pur non avendo un obbiettivo di sequenziamento uso dei primer con target specifici posso quantificare la presenza di tali gruppi nel campione (ambientale, clinico, industriale, ...)
• si definisce una curva standard di calibrazione che conforma il ciclo soglia con il numero di sequenze iniziali