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(2) FISIOLOGIA CELLULARE E NEUROFISIOLOGIA, vescicole simpatiche,…

- - - - metodo Voltage Clamp
        
        circuito di retroazione elettronica che blocca il Vm producendo una corrente uguale e contraria a quella che fluisce
        
        esempio:
        
        porto Vm a zero, si osserva una corrente rapida di Na entrante che si inverte ed osservo quindi corrente uscente,
        
        Vm pari sempre a zero perchè Na entrante bilanciato da circuito elettrico che inietta corrente per impedire al flusso di avere effetti su PA
        
        quando si attivo canali K il circuito fa l'opposto
        => sulla base della corrente che il circuito deve fornire risalgo alla corrente di membrana (complessivamente l'efficienza sul potenziale è nullo)
        
        posso anche studiare come la corrente si comporta a ≠ potenziali di membrana
        
        poi le Ik si chiudono alla fine della ripolarizzazione perchè a -70 V le correnti si chiudono a potenziali negativi (canali Na si inattivano, canali K si chiudono)
        
        corrente K più lenta ma indispensabile per ripolarizzazione e a -70 di richiudono
      - applico inibitore specifico di correnti K uscente (tetraetilammonio) e ho solo correnti Na, che quindi posso studiare a ≠ potenziali di membrana e tempi
        
        applico inibitore specifico di correnti Na (tetrarodossina, soprattutto per bloccare cellule nervose e muscolari), quindi trovo corrente K
- - - - recettori
        
        per identificarli stimolo localmente la zona della placca motrice fornendo Ach e ne studio la risposta della membrana
        
        ionoforesi: rapida e manipolabile, regolo la concentrazione di Ach o la distanza dello stimolo , ma solo nella zona della membrana post-sinapsica poiché i recettori sono in questa zona
        
        localizzo i recettori con:
        
        ionoforesi
        
        neurotossine che si legano
        
        microscopia elettronica
        
        tutti gli studi evidenziano recettori che legano le neurotossine e determinano la risposta della placca (poi isolati e identificati biochimicamente)
        
        sono canali ionici di 5 subunità che circondano il poro centrale:
        
        2 sub. alfa uguali che legano Ach
        
        si legano due Ach, una per ogni sub. alfa per avere la massima probabilità di apertura del canale
        
        subunità accessorie beta, gamma, delta
        
        ogni sub. ha un grosso dominio Nterminale extracellulare e nelle alfa contiene sito legame Ach
        
        ≠segmenti transmembrana M1, M2, M3, M4 o TM,
        con ansa lunga fra domini 3-4 su lato citosolico
        
        dominio Cterminale più breve ed extracellulare
        
        M2 delle 5 sub. formano le pareti del oro
        
        ci sono anche recettori (non in giunzione neuromuscolare) che attivano cascate di segnali intracellulari
        
        recettore nicotinico
        
        meccanismo
        
        Ach apre il canale ionico e si produce la depolarizzazione di memebrana postsinapsica
        
        canali ionici per trasmissione sinapsi veloce sono ≠ perchè meno selettivi per Na che K e molti fanno passare anche Ca (ha permeabilità simile per i vari ioni)
        
        successivamente all'apertura si ha corrente negativa (ioni entranti) a -90 mV quindi entrata di Na favorita per concentrazione elettronica (vedi formulario)
        
        se do Ach con potenziale di membrana a +60 la corrente è uscite positiva perchè Na all'equilibrio e K uscente
        => a potenziale di membrana intermedi Einv>Vm>Ek, quindi esce un po' di K, ma prevale Na entrante, quindi a metà strada fra Ek ed Era
        
        se Vm=Einv la corrente pare a zero, quindi canale si are ma la forza motrice per i due ioni è uguale ed opposta=potenziale di inversione
        
        canali ionici poco selettivi il punto di equazione 0 non è punto di equilibrio di uno ione permeante, ma è l'equilibrio di inversione che è via di mezzo tra i potenziali di equilibrio tra i principali ioni permeanti
        
        potenziale di inversione
        
        canale aperto ha corrente Na e K indipendenti , quindi assumendo flussi indipendenti e no altri ioni presenti ottengo Vinv~-20 mV (vedi formulario)
        
        quando recettori niconitici si aprono tendono a portare la cellula verso il loro Vinv, cioè verso -10 mV
        => membrana postsinapsica è eccitatoria perchè Vinv dei canali è > della soglia dell'innesco del PA (è meno negativa)
        
        grosso dominio extracellulare con necessità di legame di due Ach
        
        proteina grossa con siti di legame alfa per neurotrasmettitori lontani dal poro, quindi avviene un grosso cambiamento confromazionale che richiede energia che si ottiene solo due ligandi per la loro energia (si legano 2 Ach per 5 sub.)
        
        domini M2 formano parete del poro disposti in linea spezzata: residui di Lys e Ser sporgono in zona del poro, quando si lega Ach c'è parziale rotazione di ogni segmento delle 5 sub. di 15-20 gradi quindi si allarga il poro ed entrano i cationi
        
        gating: apertura e chiusura è dipendente dal filtro di selettività, ossia la porta del poro stesso con filtro di selettività
        
        proprietà
        
        primi ad essere studiati per proprietà del singolo canale
        
        so denerva la membrana (rimuovo neurone che innerva il muscolo) e riscontro che recettori si distribuiscono su tutta la membrana perchè è il neurone che ha funzione trofica che stimola il raggruppamento recettoriale
        
        via tecnica patch-campo per misurare correnti dei singoli canali (correnti si-no) e ne studio la cinetica del canale
        
        sempre processo statistico per cui Ach aumenta probabilità che il canale si apra, anche se esso non rimane aperto per tempi ∞ e si richiude
        
        desensitizzazione: in pressione costante del legando il canale tende a diminuire la probabilità del suo stato di attivazione
        
        desensitizzazione
        
        per sinapsi chimiche veloci non implicata nell'interruzione del segnale
        
        senza bloccante per Ach: interruzione dovuta a rimozione-degrado trasnmemebrana: a -80 mV canali si aprono poi corrente decade molto rapidamente perchè Anche degrada Ach
        
        se blocco AchE con bloccanti o esprimo canali di altri tipi cellulari non avviene: Ach c'è ma la corrente decade e i canali si chiudono per desensitizzazione, quindi dipende dai domini della proteina che costituiscono il canale
        => domini ≠ da quelli di apertura e chiusura (processo non rilevante nella placca neurone perchè AchE rimuove velocemente Ach)
        
        proprietà principali canali ionici
        
        gating: attivazione-disattivazione (inattivazione o desensitizzazione)
        
        selettività agli ioni: determina effetto specifico su membrana
        
        farmacologia: tipo di agonisti-antagonisti
        
        modulazione gattino della selettività, dell'espressione, dell'interazione con i ligandi
    - - cilco neurotrasmettitori
        
        rilasciato -> si lega -> degradato in colina e acido acetico
        
        acido acetico diffonde nello spazio extracellulare mentre colina riassorbita dalla terminazione tramite trasportatori attivi secondari sfruttando gradiente di Na, quindi riusata per sintetizzare acetilcolina con enzima colinaacetiltransferasi
        
        neurotrasmettitore caricato nella vescicola sinaptica con trasportatore attivo secondario che sfrutta gradiente di H i quali escono favorendo ingresso di Ach (accoppiato con trasporto primario H-ATP che acidifica la vescicola)
        
        trasportatori ≠ per neurotrasmettitori ≠
        
        VAchT: trasportatore vescicolare per captare Ach nelle vescicole
      - necessario usare sinapsi molto grandi per modello sperimentale per manipolare il meccanismo di trasmissione:
        
        giunzioni neuromuscolari
        
        ganglio stellato di calamaro
        
        calice di Held(vie uditive tronco celebrale di mammiferi)
        
        per comprendere:
        
        perchè PA determina il rilascio di neurotrasmettitori
        
        perchè Ca se aumenta nella terminazione stimola anch'esso il rilascio del neurotrasmettitore
        
        comprendere classi di canali Ca in struttura presinapsica
        
        meccanismo nel dettaglio di esocitosi
        
        con sinapsi grandi posso studiare tutti i segnali implicati nel rilascio dei neurotrasmettitori:
        
        stimolo cellulare per depolarizzare terminale presinapsico
        
        misuro Vm pre e post-sinapsi
        
        misuro come varia Ca intracellulare ad esempio iniettando proteine che quando legano Ca emettono luce
      - eventi presinaptici
        
        PA invade terminazione sintetica ed è necessario per lo stimolo sinaptico, se blocco canali Na -> blocco il PA -> blocco il rilascio neurotrasmettitore
        
        PA depolarizza la membrana -> rilascio neurotrasmettitore, accoppiamento depolarizzazione-rilascio
        
        legame tra depolarizzazione terminale e rilascio dipende però dal Ca esterno, se lo elimino non c'è rilascio
        
        depolarizzazione presinapsica stimola esocitosi delle vescicole perchè permette l'aumento del Ca estracellulare -> fa aprire canali Ca voltaggio dipendenti aumentando Ca nella terminazione -> Ca stimola esocitosi -> rilascio neurotrasmettitore -> ho potenziale post sinaptico eccitatorio
        
        accoppiamento depolarizzazione rilascio
        
        se porto potenziale presinaptico al potenziale di equilibrio del Ca ~200 l'effetto si blocca perchè Ca è al suo potenziale di equilibrio, quindi no flusso netto attraverso la membrana anche se apro i canali => no rilascio neurotrasmettitore
        
        dimostrazione guardando come aumenta Ca nel terminale con metodi fluorescenti e depolarizzando
        
        si può stimolare esocitosi solamente iniettando Ca nel terminale con ionofori del Ca (quindi per bloccare basta un chetante del Ca)
        
        canali Ca voltaggio-dipendenti
        
        per rilascio di neurotrasmettitori sono necessari almeno 5 Ca che legano la proteina della vescicola sinaptica: effetto cooperativo
        
        molto selettivi in condizioni fisiologiche
        
        classi 1,2,3 con proprietà cinetiche ≠:
        
        1,2 ad alta soglia cioè si aprono da -40 mV in su
        
        2 molto implicati in funzioni sinaptiche
        
        3 a bassa soglia si attivano a potenziale negativo con funzioni ≠ da 1,2
        
        rilascio rapido dipende da canali 2.1 (P,Q), 2.2 (N), 2.3 (R) soprattutto che sono su siti attivi dei presinaptici
        
        sinaptotagmine:
        
        proteine associate a membrana della vescicola con Nterminale interno e Cterminale citosolico,
        
        con complessi C2A (lega 3Ca), C2B (lega 2Ca) che legano i 5 Ca per il rilascio (processo cooperativo)
        
        simili a domini omologhi a PKC quindi con rilascio veloce e sincronizzato grazie all'interazione di questo complesso con SNARE (pp di membrana della vescicola) permettendo il contatto vescocola-memrbana cellulare per il rilascio del neurotrasmettitore