Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Baltymų evoliucijos metodai - Coggle Diagram
Baltymų evoliucijos metodai
Genetinių pokyčių įvedimo metodai
Orientuota mutagenezė
Naudojami sintetiniai DNR oligonukleotidai su keliais degeneravusiais kodonais tikslinėse vietose
Naudojama filogenetinei analizei ir molekuliniam modeliavimui
Diversifikacija rekombinacijos būdu
DNR shuffling metodas
Atsitiktinė chimeragenezė laikinuose modeliuose
(RACHITT)
Nukleotidų mainų ir iškirpimo
technologija (NExT)
Pakopinis pratęsimo procesas (StEP)
Assembly PCR
In vitro rekombinacijos metodai reikalauja esminių rankinių manipuliacijų ir paprastai po jų yra atliekama
transformacija ar transdukcija, rekombinuotos genų populiacijos įvedimui atgal į ląsteles
Nehomologinė rekombinacija: SHIPREC, ITCHY, NRR metodai
Atsitiktinė mutagenezė
Naudojami cheminiai arba fiziniai veiksniai, atsitiktinai pažeidžiantys DNR
Necheminė atsitiktinė mutacija dažnai atsiranda dėl padidėjusio klaidų dažnio DNR replikacijos metu
In vitro: error-prone PCR; padidinta magnio koncentracija; mutageniniai dNTP.
In vivo: išvystytas ortogonalinis DNR replikacijos mechanizmas, užtikrinantis tikslinę DNR mutaciją
Vieno geno evoliucijos genetinė atranka (screening'as)
Dirbtinių, į ląstelę panašių kompartmentų atranka
Naudoja vendeninius lašelius vandens-aliejaus emulsijose, kad atskirtų genus ir genų produktus kartu su pakaitiniu fluorogeniniu substratu.
Lankstumas naudoti fluorogeninius substratus išplečia fenotipus
Erdviškai atskirtų variantų atranka
Gali būti atrenkami kietos terpės kolonijose arba gali būti perkeliami į skystos kultūros lėkšteles
Kai nėra fluorescencinio žymens, substrato suvartojimą arba produkto formavimąsi tiesiogiai galima stebėti naudojant branduolinio magnetinio rezonanso (BMR), skysčių chromatografijos (HPLC), dujų chromatografijos arba masių spektroskopijos metodus.
Mutantai išsaugo ryšį tarp fenotipo ir
genotipo
Aukšto pralaidumo atranka naudojant tėkmės citometriją
Fluorescenciniu būdu aktyvuotas ląstelių rūšiavimas (FACS) remiasi nedifuziniu fluorescenciniu reporteriu, kad automatizuotu ląstelių, turinčių norimus geno variantus, identifikavimą ir išskyrimą
Citozoliniai fluorescenciniai arba iluminescenciniai baltymai lastelėse gali sudaryti fermentų FACS atrankos pagrindą, tokiems fermentams kaip rekombinazės, šaperonai ir kt.
Ląstelės epitopai taip pat nėra difuziniai ir gali bųti aptikti FACS naudojant fluorescencinį žymėjimą antikūnais.
Mielių atranka pagal baltymo-baltymo sąveiką
Funkcinių baltymų pasirinkimas
Selekcija pagal rišimosi giminingumą
Baltymų bibliotekos nariai su norimu surišimo aktyvumu ir juos koduojančia DNR seka yra fiksuojami naudojant imobilizuotą taikinį, tuo tarpu neprisirišantys, negiminingi bibliotekos nariai yra išplaunami.
Cell surface display ar phage display metoduose ląstelė arba bakteriofagas tarnauja kaip kompartmentas susieti genus ir jų produktus
Baltymų bibliotekos nariai yra ekspresuojami ląstelės paviršiuje arba ant bakteriofago apvalkalo suliejus juos su endogeniniais ląstelės paviršiaus baltymais arba fago apvalkalo baltymais
Selekcija pagal organizmo išgyvenamumą
Aktyvūs bibliotekos nariai įgalina organizmų turinčių reikiamus genus išgyvenamumą ir replikaciją. Atsparumas antibiotikams yra paprasčiausias selektyvios replikacijos pavyzdys
Auksotrofiškumas taip pat gali sudaryti
metabolinių fermentų evoliucijos atrankos pagrindą
In vitro selekcija
Gali apeiti in vivo atrankos apribojimus tokius kaip transformacijos efektyvumo suvaržymas ir šeimininko genomo mutacijos, kurios netikėtai daro įtaką atrankai
In vitro kompartmentų atranka ypač tinka fermentams, kurie tiesiogiai veikia DNR substratus.
Naudojami ne ląstelėse, o vandens lašeliuose vandens-aliejaus emulsijose
In vitro DNR ir RNR polimerazių atranka emulsijose (Kompartmentizuota savireplikacija (CSR))
Atsirandančios evoliucijos paradigmos
Nenutrūkstama evoliucija
Yra skurti metodai, kuriuose atliekami visi baltymų evoliucijos ciklai yra atliekami nuolat be rankinio įsikišimo
Nenutrūkstamos evoliucijos sistemos gali pastebimai padidinti baltymų evoliucijos ir optimalių baltymų variantų paieškos efektyvumą
Kompiuterinis dizainas ir nukreipta, tikslinė evoliucija
Kompiuterinis baltymų dizainas gali inicijuoti erdvinės sekos tyrinėjimą, pradedant vietomis, kurios yra neprieinamos evoliucijos procesams, kilusiems iš natūraliai egzistuojančių genų. Todėl šis metodas gali paspartinti evoliuciją visiškai naujų baltymų funkcijų.