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4_ Dynamic Light Scattering - Coggle Diagram
4_ Dynamic Light Scattering
Generale
Sensibile
agli
aggregati proteici
il
segnale
che riceviamo
è
direttamente proporzionale alle dimensioni
(nm) degli oggetti
Serve
per
capire le DIMENSIONI
degli oggetti in soluzione
Supponiamo di avere un
campione proteico
in soluzione
e immaginate di
colpirlo
con
luce visibile
(monocromatica, un laser)
Cosa succede quando il laser incontra
oggetti più piccoli della lungh d'onda?
fenomeno di
Scattering
(di diffusione)
Rayleigh Scattering
E’ quel fenomeno
Avviene quando una
luce
di una certa lunghezza d’onda
colpisce
delle
particelle
che sono
molto più piccole
della lunghezza d’onda stessa.
questo fenomeno
fa sì
che
l’intensità della luce
diffusa è Inversamente Proporzionale a
Lambda
alla
4
Cosa vuol dire Scattering?
c’è la diffusione della luce.
La particella ri-emette luce in tutte le direzioni,
Questa diffusione è tale per cui
L
'intensità della luce diffusa
è inversamente proporzionale
al quadrato della lungh. d’onda
.
Cosa vuol dire dinamico
(dynamic like scattering)?
Il segnale lo guardiamo
non istantaneamente ma
nel tempo
(segnale dinamico)
si scopre che
modulazione (dell'intensità della luce diffusa nel tempo)
è legata alle
dimensioni
particelle Grandi
=
modulazione più lente
particelle Piccole
=
modulazioni più strette / frequenti
perchè questo ?
L’INTENSITA' della luce diffusa
fluttua a seconda
Velocità
di come si muovono le particelle in soluzione
delle
Dimensioni
Quanto sarà questo segnale ?
(Intensità della luce diffusa)
Devo
sommare le DUE onde
che hanno la stessa energia di quella incidente
Il primo parametro che misuro è
il coefficiente di diffusione,
Quanto si muovono
le molecole in soluzione.
Abbiamo una
funzione intensità di luce diffusa nel tempo
, che ha una modulazione.
Dobbiamo ricavare il
coefficiente di diffusione.
Per ottenere
informazioni quantitative
da segnali di questo tipo
Funzione di autocorrelazione
si vede
come l’intensità sia correlata con se stessa
nel tempo.
La limitiamo da 0 a infinito ( tanto è simmetrica)
L’intensità della luce
diffusa (IS) è una
funzione del tempo
.
“time scale”
una
frequenza media
delle oscillazioni nel tempo
correlate
alla velocità di diffusione
delle particelle
e
quindi alle loro dimensioni.
(ts. lunga vuol dire che la particella è grande)
MORALE
ci fate la funzione di autocorrelazione avete un qualcosa che decade nel tempo,
da quanto velocemente decade
nel tempo
voi avete un'idea del D, coeff di diffusione delle molecole responsabili.
In che modo ?
Da una
curva che decade velocemente ricaviamo un D grande e viceversa
Abbiamo una funzione del tempo, + o - oscillante,
Si può dimostrare che ha un
decadimento esponenziale
:
Una funzione
G(τ)
che decade esponenzialmente.
E nell'esponenziale e(-Γτ) è presente una grandezza Γ (gamma) in cui all’interno è
presente D
(coefficiente di diffusione)
Quindi noi
possiamo ricavare D
perché fa parte dell'esponenziale.
Quindi mi da già un’idea se
D
è
piccolo
è una piccola molecola
è
grande
è una grande molecola.
si normalizza la funzione va da 2 a 1
Questo
Esponente
determina
quanto velocemente è il decadimento
, lì è l’info.
Più grande è questo esponente più velocemente decade
la curva.
Più
piccole sono le particelle
che hanno un
coeff di diffusione più grande
faranno
decadere più velocemente
questa funzione di autocorrelazione.
E il
D dov’è
?
è nel gamma.
Considero un
certo tempo T,
dove ho la
> variazione
?
Dove ho la maggior variazione
meno
correlata
è + diversa da se stessa,
.
Più l’oggetto è grande meno velocemente si ha la decrescita della funzione esponenziale.
Dal
D ricaviamo
dal
coeff di diffusione
perché vale la legge di stock Heinsten,
posso ricavare il
raggio della molecola
che diffonde con quel coeff di diffusione.
il diametro
di questi oggetti,
Se
r è piccolo D è grande
,
è inversamente proporzionale,
le piccole molecole si muovono + velocemente
Ma come facciamo a ricavare il valore di peso molecolare?
...se si parla di
cose ideali...
In sequenza:
Ricavo D
Ricavo
Rs
grazie a D
Ricavo il
peso molecolare
grazie a Rs sapendo D.
Mediante la relazione di Stokes-Einstein
Mette in
relazione il D e il raggio RS
detto appunto raggio di Stokes ,
quindi potete sapere
quanto è grande questo oggetto
Saputo il raggio RS
posso calcolare anche il PM (PM del n° di Avogadro di quegli ogg lì)
Osservazione Importante:
L’
intensità della luce
diffusa è
Proporzionale al PM al quadrato
Siccome il pM è proporzionale al cubo del raggio
è
proporzionale 6° potenza
del raggio, e quindi R6
Quindi
un ogg grande diffonde di più
del oggetto piccolo
Quindi oggetto grande diffonde più velocemente dell' oggetto piccolo
... con le proteine
Con il
DLS
Si misura il
R di Stock
(raggio di un ogg sferico che ha quel coeff di diffusione)
A seconda della
forma
che ho la relazione
PM - raggio cambia,
Per sfere rigide R2, per bastoncini R inteso come la lunghezza.
tecnica DLS è
molto sensibile agli aggregati proteici.
Che relazione c’è tra raggio e PM?
PM dipende R2,
ha una dipendenza minore della sfera rigida.
Nel caso di una
proteina foldata
?
A livello sperimentale si è trovato che
per le
proteine il PM dipende da R alla 2 ,46
Meno compatto
di una sfera rigida,
non è così aperta
come un random coil
QUINDI
Noto D ricavo
RS
e posso ricavare il PM.
α calcolata empiricamente
dalla relazione empirica di Mark-Houwink.
Qui sto parlando che
ho solo una proteina in soluzione
e questa tecnica a risoluzione alta
mi dice come è la mia proteina
.
NB: IS proporzionale ad α2 e quindi a PM2, cioè a R4,92 per proteine.
Che cos’è ? è il raggio delle mia proteina ?
è il raggio di una sfera rigida
che ha lo stesso coeff di diffusione della mia proteina.
Io quello che misuro è il
coeff di diffusione
e dipende dalla mia proteina,
poi
nel passare
da quello al raggio
ipotizzo che sia una sfera rigida,
quindi
il raggio che ricavo è
il raggio di una sfera rigida che si muove in soluzione
con la stessa velocità della mia proteina.