4_ Dynamic Light Scattering
Generale
Sensibile
Serve
per capire le DIMENSIONI degli oggetti in soluzione
agli aggregati proteici
il segnale che riceviamo
è direttamente proporzionale alle dimensioni (nm) degli oggetti
Supponiamo di avere un campione proteico in soluzione
e immaginate di colpirlo con luce visibile(monocromatica, un laser)
Cosa succede quando il laser incontra oggetti più piccoli della lungh d'onda?
fenomeno di Scattering (di diffusione)
Rayleigh Scattering
E’ quel fenomeno
Avviene quando una luce di una certa lunghezza d’onda colpisce delle particelle che sono molto più piccole della lunghezza d’onda stessa.
questo fenomeno fa sì che l’intensità della luce diffusa è Inversamente Proporzionale a Lambda alla 4
Cosa vuol dire Scattering?
c’è la diffusione della luce.
Questa diffusione è tale per cui
La particella ri-emette luce in tutte le direzioni,
L'intensità della luce diffusa è inversamente proporzionale al quadrato della lungh. d’onda.
Cosa vuol dire dinamico (dynamic like scattering)?
Il segnale lo guardiamo non istantaneamente ma nel tempo (segnale dinamico)
si scopre che
modulazione (dell'intensità della luce diffusa nel tempo) è legata alle dimensioni
particelle Grandi =modulazione più lente
particelle Piccole =modulazioni più strette / frequenti
L’INTENSITA' della luce diffusa
fluttua a seconda
Velocità di come si muovono le particelle in soluzione
delle Dimensioni
Quanto sarà questo segnale ? (Intensità della luce diffusa)
Devo sommare le DUE onde che hanno la stessa energia di quella incidente
perchè questo ?
Il primo parametro che misuro è
il coefficiente di diffusione,
Quanto si muovono le molecole in soluzione.
L’intensità della luce diffusa (IS) è una funzione del tempo.
“time scale”
una frequenza media delle oscillazioni nel tempo
correlate alla velocità di diffusione delle particelle
e quindi alle loro dimensioni.
(ts. lunga vuol dire che la particella è grande)
Abbiamo una funzione intensità di luce diffusa nel tempo, che ha una modulazione.
Dobbiamo ricavare il coefficiente di diffusione.
Per ottenere informazioni quantitative da segnali di questo tipo
Funzione di autocorrelazione
si vede come l’intensità sia correlata con se stessa nel tempo.
La limitiamo da 0 a infinito ( tanto è simmetrica)
MORALE
ci fate la funzione di autocorrelazione avete un qualcosa che decade nel tempo,
da quanto velocemente decade nel tempo
In che modo ?
Si può dimostrare che ha un decadimento esponenziale:
Una funzione G(τ) che decade esponenzialmente.
E nell'esponenziale e(-Γτ) è presente una grandezza Γ (gamma) in cui all’interno è presente D (coefficiente di diffusione)
Quindi noi possiamo ricavare D perché fa parte dell'esponenziale.
Quindi mi da già un’idea se D
è piccolo è una piccola molecola
è grande è una grande molecola.
si normalizza la funzione va da 2 a 1
Questo Esponente determina quanto velocemente è il decadimento, lì è l’info.
Più grande è questo esponente più velocemente decade la curva.
Più piccole sono le particelle che hanno un coeff di diffusione più grande
faranno decadere più velocemente questa funzione di autocorrelazione.
E il D dov’è ?
è nel gamma.
Abbiamo una funzione del tempo, + o - oscillante,
voi avete un'idea del D, coeff di diffusione delle molecole responsabili.
Da una curva che decade velocemente ricaviamo un D grande e viceversa
Considero un certo tempo T, dove ho la > variazione ?
Dove ho la maggior variazione
Più l’oggetto è grande meno velocemente si ha la decrescita della funzione esponenziale.
meno correlata
è + diversa da se stessa, .
Dal D ricaviamo
dal coeff di diffusione
il diametro di questi oggetti,
perché vale la legge di stock Heinsten,
posso ricavare il raggio della molecola che diffonde con quel coeff di diffusione.
Se r è piccolo D è grande,
è inversamente proporzionale,
le piccole molecole si muovono + velocemente
Ma come facciamo a ricavare il valore di peso molecolare?
...se si parla di cose ideali...
In sequenza:
Mediante la relazione di Stokes-Einstein
Mette in relazione il D e il raggio RS detto appunto raggio di Stokes ,
Saputo il raggio RS
quindi potete sapere quanto è grande questo oggetto
posso calcolare anche il PM (PM del n° di Avogadro di quegli ogg lì)
Ricavo D
Ricavo Rs grazie a D
Ricavo il peso molecolare grazie a Rs sapendo D.
... con le proteine
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Osservazione Importante:
L’intensità della luce diffusa è
Quindi un ogg grande diffonde di più del oggetto piccolo
Quindi oggetto grande diffonde più velocemente dell' oggetto piccolo
Proporzionale al PM al quadrato
Siccome il pM è proporzionale al cubo del raggio
è proporzionale 6° potenza del raggio, e quindi R6
Con il DLS
Si misura il R di Stock (raggio di un ogg sferico che ha quel coeff di diffusione)
Per sfere rigide R2, per bastoncini R inteso come la lunghezza.
A seconda della forma che ho la relazione PM - raggio cambia,
Che relazione c’è tra raggio e PM?
PM dipende R2, ha una dipendenza minore della sfera rigida.
Nel caso di una proteina foldata?
A livello sperimentale si è trovato che
per le proteine il PM dipende da R alla 2 ,46
Meno compatto di una sfera rigida,
non è così aperta come un random coil
QUINDI
tecnica DLS è molto sensibile agli aggregati proteici.
Noto D ricavo
RS
α calcolata empiricamente dalla relazione empirica di Mark-Houwink.
Qui sto parlando che ho solo una proteina in soluzione e questa tecnica a risoluzione alta mi dice come è la mia proteina.
NB: IS proporzionale ad α2 e quindi a PM2, cioè a R4,92 per proteine.
e posso ricavare il PM.
Che cos’è ? è il raggio delle mia proteina ?
è il raggio di una sfera rigida che ha lo stesso coeff di diffusione della mia proteina.
Io quello che misuro è il coeff di diffusione
e dipende dalla mia proteina,
poi nel passare da quello al raggio
ipotizzo che sia una sfera rigida,
quindi il raggio che ricavo è il raggio di una sfera rigida che si muove in soluzione
con la stessa velocità della mia proteina.