Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Tikslinės baltymų evoliucijos metodai - Coggle Diagram
Tikslinės baltymų evoliucijos metodai
Atsirandančios evoliucijos pradigmos
Besitęsianti evoliucija
Atrastas metodai, kuriais atliekami visi baltymų evoliucijos ciklai
yra atliekami nuolat be įsikišimo.
Šios nenutrūkstamos evoliucijos sistemos gali pastebimai padidinti baltymų evoliucijos efektyvumą dėl nuolatos vykstančių ciklų ir mutacijų. Taip gali būti tiriama ir ieškant optimalių baltymų variantų.
Kompiuterinis dizainas ir tiesioginė evoliucija
Galima kurti baltymus nuo visiško nulio, modeliuoti erdvėje matyti kaip jie atrodo ir veikia. Taip galima sukurti baltymų evoliucija ir matyti kaip keičiasi baltymo funkcijos
Metodai naudojami paįvairinti genus.
Rekombinantinis įvairinimas
Originalus DNR maišymo metodas ( DNR shuffling). DNR sukarpoma DNRasių ir PCR reakcijos metu leidžiama fragmentams atsitiktinai susijungti.
Natūrali rekombinacija gali būti atkartojama naudojant homologinę rekombinaciją.
Panašūs principai naudojami ir kituose metoduose:
dažniausiai naudojamas assembly PCR.
random chimeragenesis on transient templates(RACHITT)
Nucleotide exchange and excision technology (NExT)
staggered extension process (StEP)
ir kiti
Ne homoloinė rekombinacija : Incremental truncation for the creation of hybrid enzymes (ITCHY) metodas sukuria hibrininį baltymą suliejant du genus.
Kiti metodai SHIPREC, NRR
Atsitiktinės mutacijos
Ne cheminiai metoda i- daromos klaidos vykstant DNR replikacijai.
Vykdoma In Vivo. Tačiau organizmai gali limituoti mutacijų skaičių. Kad būtu išvengiama tokių suvaržymų renkamasi in vitro arba mokslininko C. C. Liu sukurtą DNR replikacijos mechanizmą,kuris atlieka mutacijas tik tiksliniame gene.
In Vitro. Naudojamas erorr - prone PGR. Kiekvienos replikacijos metu gauname vis daugiau klonų turinčių daugiau mutacijų. Taip pat dNTP kiekio skirtumai gali sukelti mutacijas
Gali būti naudojami cheminiai arba fizikiniai agentai, kurie atsitiktinėse vietose pažeidžia DNR.
Fokusuotos mutagenezės strategijos
Pasirenkame kai norime mutuoti/pakeisti kelis nukleotidus tame pačiame kodone.
Dažniausiai naudojami sintetiniai DNR oligonukleotidai, kurie turi vieną ar kelis neatitinkančius kodonus. Jų pozicija atitinka taikyninio geno, kurį norime mutuotį, poziciją
Daug individualių mutacijų gali neturėti įtakos ( neutralios) arba neturėti mums reikiamos raiškos. Fokusuotos mutagenezės strategijos naudojamos norint įvesti specifinę aminorūgštį, kuri tikėtina, bus naudinga
Naudojama filogenetiniams tyrimamas ir molekuliniam modeliavimui
Genetinis screening'as vieno geno evoliucijoje. Mutantų atranka
High-throughput screening'as
naudojant tekmės citometriją
Fluoresenciniu aktyvumu paremtas ląstelių selekcija (FACS)
Mielių ekspozicijos sistema
Atskiriama pagal baltymo-baltymo sąveika
ryšio formavimą
peptidinio ryšio skėlimą.
Paviršiaus žymenys
Jei ląstelės membrana ir sienelė išlaiko fenotipį ir genotipį ryšį, galima kolonijose esančias ląsteles tirti kaip individualias
Dirbtinių, į ląstelę panašių kompartmentų screening'as
Naudojami vandens ląšelių vandens-aliejau emulsijos individualių genu produktų arba genų kompartmentavizavimui. Taip pat patalpinamas ir fluorogeninis substratas, kuris bus reikalingas FACS analizei.
Naudojama kai negalimaa paprsastai įterpti fluoresencinio žymens
Erdviškai atskirtų mėginių screening'as
Individuose yra išlaikoma fenotipinė ir genotipinė sąsaja.
Genų eksepresijai dažniausiai naudojami vienaląsčiai organizmai kaip E.Coli. galy būti tiriamos kaip kolonijos ant kietos terpės arba perkeliamos ant daugialypės skystos terpės lėkštelėse.
Gali būti derinama su įvairiais analizės metaodais.
Jei nėra galimas fluoresencinis "skaitymas" naudojama, (dėl mažo laidumo ): nuclear magnetic resonance (NMR), high-performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography arba mass spectroscopy, kad galėtume sekti substrato sunaudojimą arba produkto sunaudojimą.
Esant aukšto laidumo screen'inimui galima pasikliauti greitu įvertinimu naudojant optines savybes tokias kaip spalva: fluorescencija, liuminescencija ar drumstumas
Funkcinių baltymų atranka
Selektyvumas pagal organizmo išgyvenamumą.
Vienas dažniausiai naudojamų genų yra atsparumas antibiotikams. Pasižymi antibiotikų neutralizavimu ar jų išmetimų iš ląstelės
Įvedamai tokie genai, kurie padėtu ląstelės išgyventi netinkamoje aplinkoje ir augti
Auksotrofiškumas taip pat gali būti naudojamas kaip atrankos faktorius. pavyzdžiu jei terpėje bus ksilozės o ląstelė jos negalės suskaidyti, ji žus. Lątelės turinčios ksilozės metabolizmui reikalingus genus ją skaido ir naudoja kaip "bio degalus"
Selekcija in vitro kompartmentuose
Nėra naudojamos ląstelės. Naudojami vandens ląšelio vandens-aliejaus emulsijos
Tinkamas fermentams, kurie tiesiogiai skaido DNR substratus
Kompartmentalizuota savireplikacija CSR
Kompartmentalizuota asocijuota replikacija CPR
Selektyvumas pagal ryšimosi afiniškumą/giminingumą
Naudojamos fagų - baltymo genas faguose ekspresuojamas taip jog jis būtu išreikštas jo paviršiuje/apvalkale,
Ląstelių - ekspreuojama ant ląstelės sienelė. tačiau abu metodai turi limituojančia bibliotekos įvairovę, tai išsprendžia sekantis metodas
Ribozomų ekspozicijos sistemos - sukūrus palnkias salygas ribozimai gali likti ant mRNR grandinių.
Metodų principas Turi turėti rišimosi aktyvumą. Tai žinome iš baltymu bibliotekos. Naudojame taikininių baltymu imobilizavimą. Baltymai neturintys norimo rišimosi aktyvumo yra išplaunami.