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TECNICHE IMMUNOCHIMICHE - Coggle Diagram
TECNICHE IMMUNOCHIMICHE
ANTICORPI
- glicoproteine formate da 2 catene leggere L e due catene pesanti H
- catene legate con ponti disolfuro
- non sono solubili
- presiedono immunità umorale
- IgG: 150 kDa, di cui L 25 kDa e H restante
- H e L costituiti da domini immunoglobulinici Ig, strutture stabili selezionate dall'evoluzione
- domini immunoglobulinici: 110 aa rendono anticorpi resistenti e stabili
- H e L con regioni variabili con legame antigene e regioni costanti con funzione effettrice
- regioni cerniera permettono movimento delle zone e rendono anticorpo flessibile: legano le due H con le L, sono i ponti disolfuro
regioni variabili
- variabilità dipende nelle sequenze aa di Ig che concentra in zone di iperviabili che determinano la specificità
- sono regioni che determinano la complementarità (CDR1, CDR2, CDR3 in H e altrettante in L)
- regioni ipervariabili: ~ 10 aa, 3 in VH e 3 in VL
- 6 regioni ipervariabili si associano in struttura 3D che forma sito di legame per antigene
ogni molecola anticorpale contiene due tipi di regioni costanti L, H . Ma in particolare CH determinano la classe anticorpale-isotipo, e la funzione effettrice di anticorpo
- sito di legame formato da disposizione 3D delle regioni variabili di una H e di una L
- trattamento anticorpi con enzimi proteolitici genera frammenti con ≠ caratteristiche, che danno anche il nome alle regioni
Fab: frammento con sito di legame per antigene (papaina), contiene entrambe le regioni variabili di H e tutte L
Fc: frammento cristallizzatile contente zone costanti di H
Ig classificate in 5 isotopi:
- IgA: dimentiche, secretorie prodotte dalle lacrime
- IgD
- IgG: seconda risposta anticorpale, più specifiche quindi con > t di produzione, monomeriche
- IgE: coinvolte nelle allergie
- IgM: pentameriche, sono la prima risposta immunitaria, quindi poco specifiche
anticorpo lega piccola parte di un antigene: epitopo
si distinguono quindi nel # di epitopi che legano:
- policlonali: miscela di anticorpi con + siti di legame per antigeni ≠ o non, ma comunque che legano + epitopi con affinità ≠ (specificità da legame cooperativo)
formano reticolo tridimensionale quando legano ≠ epitopi che può facilmente precipitare con centrifugazione
- monoclonali: anticorpi diretti contro lo stesso antigene, quindi un solo epitomo
PRODUZIONE ANTICORPI
policlonali
Gli anticorpi vengono ottenuti
immunizzando un coniglio:
1° giorno - Prelievo del siero preimmune
8° giorno - Immunizzazione con l ’ antigene in adiuvante di Freund completo
20°-25° giorno – primo richiamo con l’antigene in adiuvante di Freund incompleto
35°-40° giorno – prelievo del siero immune e valutazione del titolo anticorpale
50°-55° giorno – secondo richiamo
65°-70° giorno – prelievo di sangue
anticorpi monospecifici: sempre poligonali, ma diretti ocontro lo stesso antigene, sono differenti anche nellìestrazione da coniglio e sono anche quelli che si producono maggiormente
possono essere purificati con cromatografia per affinità (eluite in condizioni drastiche pH 2, urea, 3M, … in quanto anticorpi sono stabili)
purificazione
- Separazione del siero dal coagulo mediante
centrifugazione
- Inattivazione della frazione del complemento per 20’ a
56°C
- Precipitazioni in ammonio solfato fino all’ottenimento
di un pellet bianco
- Dialisi. per rimozione ammonio solfato
- Una cromatografia a scambio ionico nel sistema FPLC
(mono Q) consente di separare IgG, IgA e IgM.
monoclonali
- anticorpi identici tra di loro in quanto prodotti da un solo tipo di cellule B (cloni cellulari).
- hanno siti di legame per l’antigene identici, cioè si legano allo stesso epitopo con la stessa affinità
- appartengono necessariamente alla stessa classe
- non precipitano perché non formano reticolo antigene-anticorpo
- per produzione anticorpi si selezionano topi albini femmine
- topi vengono immunizzati con antigene opportuno (con andamento uguale a policlonali) ma alla fine topolino sacrificato per estrazione delle cellule della milza
- quindi cellule fuse in polietilengliole e coltivate in HAT
- cellule estratte dalla milza sono linfociti B che non crescono in coltura
- si aggiungono in coltura cellule di mieloma cresciute in vitro, quindi in grado di riprodursi, per sviluppo di ibridomi
- selezione nel terreno HAT (HAT Trick):
- Il terreno HAT contiene ipoxantina, aminopterina (un
inibitore della via ex novo) e timidina
- Le cellule di myeloma sono difettive per quanto riguarda l’HGPRT (Hypoxanthine-Guanine PhosphoRibosylTransferase); sintetizzano le basi azotate solo attraverso la via ex-novo. Non sopravvivono in presenza di aminopterina
- I linfociti non sopravvivono in coltura
- Solo gli ibridomi (che hanno ereditato dai linfociti una HGPRT funzionale e dal myeloma la capacità di crescere in coltura) sopravvivono
purificazione
- cellule piastra lasciate in incubatrice per 15 gg, da cui ricavo un tappeto di cellule morte e 1-2 cloni di ibridomi
- posso coltivarle in coltura o rimpiantarli in vivo e rimuovendo successivamente un tumore solido dal topo (più sterile di vitro)
- estrazione e chiarificazione della pp: con centrifugazione dal surnatante, pH e conc salina di surnatante aggiustati da binding buffer e chiarificazione con filtri
- quindi cromatografia di affinità in diluizioni drastiche ed elettroforesi SDS-page o natia da cui ricavo due o una corsia rispettivamente di anticorpi monoclonali purificati
applicazioni
- diagnostiche: biochimica clinica
- terapeutiche: farmaci antitumorali, chimerici etc.
- classificazione (esempio RITUXIMAB):
- mab: monoclonale
- xi: chimerico
- tu: target-tumorale
- ri: specificità
WESTERN BLOTTING
Consiste nel trasferimento delle proteine separate in elettroforesi su di un foglio di nitrocellulosa mediante elettroblotting (il capillary blotting è poco usato e poco efficiente).
- Le proteine una volta raggiunta la nitrocellulosa si legano con interazioni idrofobiche alla nitrocellulosa
- Il filtro viene colorato con rosso ponceau per verificare l’avvenuto trasferimento
origine nome
- Southern blot: primo sistema con nome scienziato, sempre funzionamento per capillarità: applicando elettroforesi in agarosio, e applicando tampone su cella orizzontale con diversi strati fra campione di DNA denaturato (gel-membrana-foglio-peso) e foglio di carta si vede la risalita del DNA per capillarità sino alla membrana filtrante da cui escono DNA che si fissano sul foglio
- successivamente Northen blot: simile ma applicazione del RNA
- quindi ultima chiamata Western
componeneti
membrana
- nitrocellulosa
- PVDF: polivinilidene difluoride, per pp ad alto peso molecolare
sistema di trasferimento
- tank transfer: sistema sandwich con membrane, pesi gel e carta filtro, sviluppato in orizzontale in una vaschetta in presenza di elettrodi (gel-membrana-carta-spugnette-supporto)
- semidry transfer: sempre in presenza di elettrodi ma il tutto non immerso in una vaschetta, comunque effetto sandwich
tampone
- con SDS-page uso stesso tampone di corsa già denaturante a cui aggiungo tris-glicerina con 10-20% di metanolo
- se parto non da SDS-page uso CAPS con pH11 e sempre metanolo
- il trasferimento può essere sia ad alto amperaggio (400 mA) per 2h sia a basso amperaggio ma per più ore refrigerando in entrambi i casi
verifica trasferimento
- membrana incubata con rosso Ponceau per occhi minuti quindi lavata in H2O
- colorante rimosso in soluzione salita con detergente Tween20
- oppure uso marker colorati
IMMUNOSTAINING
-
- saturazione: dopo elettroforesi, si incuba il filtro in soluzione proteica (5% latte o BSA, Tween20 0,2%), per saturare i siti del filtro ed evitare legami specifici di anticorpi (per un ora a pH neutro e tampone PBS)
- anticorpo primario: anticorpo specifico diretto contro la pp che viene diluito nella stessa soluzione di saturazione per t da 1 a 12 h, può essere sia monoclonale che policlonale
- lavaggi: si lava anticorpo non legato in soluzione salina e detergente, quindi misurato ciò che è sceso
- anticorpo secondario: incubazione con IgG specifiche coniugate in sistema di rivelazione (colorazione)
- lavaggi: secondo ciclo di lavaggi per rimuovere eccesso di anticorpo secondario
- detection: colorazione con metodo enzimatico colorimetro o chemioluminescenza (ECL)
sistemi di rivelazione
- radioisotopico: uso I125, primo sviluppato, ma pericoloso per radioattività e si fissa alla tiroide
- fluorescenza: con fluorescenza o rosso Texas, AlexaFluor (disponibili in ampio raggio di lambda), per immunoistochimica
- enzimatico: con perossidi, fosfatasi alcalina
- avidina-biotina: sistema di amplificazione del segnale, biotina si lega covalentemente a anticorpo secondario e ogni molecola di avvicina lega 4 di biotina, per il rivelamento finale si usa enzima anch'esso biotinilato
- chemioluminescenza: per western blot perch si usano composti insolubili, anche per controllo di caricamento
-
IMMUNOISTOCHIMICA
transfezione
- inserimento di DNA ricombinante in cellule di mammifero
- non tutte le cellule possono essere transfettate con successo
- processo inefficiente
- necessaria alto # di cellule per una buona uscita
- si usano linee cellulari immortaliate: crescita medium chimicamemente definito per tempo indefinito, rapida duplicazione
vettore
- plasmide
- virus
- entrambi devono possedere ciò che esprime il dna esogeno: promotore con
- corte sequenze nucleotidiche
- danno inizio a trascrizione
- enancher derivati da virus (SV40, LTR, cous sarcoma virus, CMV)
- silencer
- fattori per selezione ad anticorpi
- resistenza ORI: sito inizio replicazione
transiente
- esperimenti a breve termine
- cellule raccolte 48-72 h post transfezione
- overespressione genica
- popolazione cellulare disomogenea: poche cellule con molto plasmide
- immediata
stabile
- esperimenti a lungo termine
- possibilità di isolare e propagare cloni singoli contenenti dna transfettato
- plasmide si integra in genoma, processo lungo e laborioso
- integrazione causale
- necessario marker di selezione (morfologia, resistenza a sostanze)
- popolazione cellulare omogenea: molte cellule poco plasmide
metodo
- deve avere elevata efficienza
- bassa tossicità
- riproducibilità in vitro e vivo
- due metodi: 1. chimici, 2. fisici
processo
- introdurre dna nella cellula
- ottenimento espressione gene di interesse
- caratterizzazione del gene/pp prodotta
il dna è composto da zona polare che deve superare membrana lipofila
1. CHIMICI
calcio fosfato:
- dna a contatto con soluzione di fosfato di calcio forma precipitati con legami elettrostatici i quali con meccanismo poco noto (endocitosi) entrano nelle cellule
- ioni bivalenti promuovono ingresso di acidi nucleici in membrana
- metodo economico e versatile, ma aggregati sono delicati e influenzati da pH, non tutte le cellule trasmettano e c'è tossicità
liposomi
- misto tipici policationici e neutri
- permette formazione di vescicole liposomiali unilamellari con carica netta +
- testa cationi del composto lipidico si associa a gruppi P negativi di acido nucleico
- complessi lipidi DNA si fondono con membrana cellulari e rilasciano spontaneamente il loro contenuto nelle cellule
- poco tossico, ma difficile produrre lisosomi, alta variabilità, costoso
- esempio LIPOFECTAMINA
2. FISICI
elettroporazione
- cellule poste in soluzione con DNA ed esposte a breve impulso elettrico che crea elettrofori su membrana cellulare poiché varia momentaneamente il potenziale di membrana
- dna entra direttamente senza passare nel compartimento endosomiale che può dar luogo a degradazione
- necessità di ottimizzare condizioni di campo elettri /durata ed intensità)
- elevato livello tossicità
microiniezione
- dna inserito in cellula nel citoplasma o nel nucleo con un capillare di vetro e sistema ad alta pressione
- sofisticata apparecchiatura (microscopio, micromanipolatore, iniettore) e personale specializzato
- effettua trasferimento selettivamente nel citoplasma o nel nucleo, efficienza di espressione >, modula livello di espressione
- tecnica impegnativa, poche cellule alla volta, costoso
-