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Biotecnologie - Coggle Diagram

- - - - Purificazione (con enzimi, membrane o resine)
      - (Lisi della parete cellulare nei vegetali)
      - Scioglimento in acqua
      - Lisi campione (detergenti)
    - - enzima EcoRI (escherichia coli), taglio sfalsato nelle sequenze palindrome pernette ricombinazione con legami a idrogeno fra basi code sfalsate e uniti da legame fosfodiesterico con enzima)
      - enzima PvuII (taglio piatto, piú complessa ricombinazione)
      - Metilazione del DNA batterico lo protegge
      - enzima HpaI (isolare frammenti di restrizione con lunghezza maggiore relativi all'anemia falciforme)
    - - Frammenti di DNA+colorante blu in un pozzetto (cavità vicino polo negativo) e marker (DNA di dimensione note) in un altro pozzetto
      - Molecole piccole vanno piú lontano di quelle grandi
      - DNA visualizzato con UV
    - - Legami 3'-5'-fosfodiesterici
      - ATP e temperature precise
  - - - Vettori
        
        Vettore di clonaggio (plasmide, 15000 n.)
        
        Geni marcatori: essere identificabile (es. proteine fluorescente verde GFP)
        
        Siti unici di restrizione: inserire frammento da clonare
        
        Vettore di espressione (vettore di clonaggio+promotore e terminatore): produzione proteine
        
        Origine di replicazione
        
        Vettori cromosomici
        
        Fagi (piú complessi, 8000-20000 n.)
        
        Cromosmi artificiali
        
        Cromosoma batterico artificiale (BAC, derivato da fattore F)
        
        Cromosomi artificiali di lievito (YAC): eucariotici (telomeri, centromeri e piú origini di replicazione, i piú grandi)
        
        Cosmidi: plasmidi con impacchettamento cos (virale) 32000-5000 n.)
      - Enzimi di restrizione
      - Ligasi
    - - Isolare DNA da clonare
      - Ligazione: unire plasmide e DNA da clonare
      - Acquisizione plasmide per trasformazione
        
        Shock Termico
        
        Terreno nutritivo
        
        Cellule batteriche competenti (facilitate ad acquisire DNA esogeno)
      - Distinguere batteri che hanno assorbito il plasmide con marcatore di resistenza (es. gene resistenza antibiotico)
      - Distinguere cellule con lo specifico gene con marcatore di selezione (es. lacZ) nel sito di clonaggio multiplo
        
        X-gal (galattosio+indolo). Se c'è il gene diventa blu (no incorporato plasmide ricombinante)
  - - - Piastrare batteri
      - Con membrane di nylon o nitrocellulosa si fanno delle repliche
      - Ibridazione DNA con sonde di DNA che corrispono al gene specifico (fosforo riadioattivo per individuarle)
      - Filtro lavato e sonde identificate
    - - Estrazione mRNA da tessuto
      - Stampo per trascrittasi inversa
  - - - DNA stampo
      - Due primer con gruppo -OH all'estremità 3'
        
        No appaiamenti reciproci (self annealing)
        
        No ripiegamenti
      - DNA polimerasi stabile ad alte temperature (Taq polimerasi)
      - Termociclatori automatizzati: variazioni di temperature senza spostare provette
    - - Denaturazione: seprazione catene complementari tramite riscaldamento
      - Annealing: i primer si legano al DNA e innescano DNA polimerasi
      - Sintesi: sequenza stampo replicata
    - - Identificazione e ricerca microrganismi
      - DNA fingerprinting (genetica forense)
        
        Analisi di microsatelliti, brevi sequenze ripetute in tandem.
        
        Ogni individuo ha un certo numero di ripetizioni. + ripetizioni = segmento + lungo
        
        Primer con marcatore fluorescente di colori diversi per diversi loci
        
        Analisi dimensione con laser
      - Copia RNA (PCR a trascrizione inversa)
  - - - DNA polimerasi
      - Primer
      - 4 dNTP
      - 4 dideossinucleotidi trifosfato (ddNTP), colorante fluorescente di diverso colore
    - - Denaturazione DNA
      - DNA polimerasi inizia sintesi filamento complementare che si ferma quando viene aggiunto ddNTP (non permette legame nucleotide succesivo)
      - I frammenti sono separati con elettroforesi e con il laser leggiamo successione dei colori
      - Si conosce l'identità dell'oligonucleotide e l'ultimo nucleotide bisogna ordinare i frammenti dal piú piccolo al piú grande
    - - Ricerca di mutazioni per malattie genetiche (con primer specificI)
      - Interi genomi (con metodo shotgun che ricorre a bioinformatica per ordinare i frammenti)
- - - - OGM di 2^ generazione: caratteristiche aggiuntive (vitamine o antiox) (es. Golden Rice per accumulare β-carotene)
      - OGM di 3^ generazione: vaccini orali (risolverebbero trasporto e conservazione nei paesi poveri) o farmaci o biocombustibili
      - OGM di 1^ generazione: efficienza agricola (es. gene Bt letale per insetti)
    - - Plasmide Ti (dal batterio rimossi geni che causavano il tumore e si puó attraversare parete cellulare)
      - Metodo Biobalistico (per piante monocotiledoni, bombardamento cellule con particelle d'oro o tungsteno rivestite di frammenti di DNA)
  - - - Vettori retrovirali in embrioni
      - Microiniezione in uova fecondate
      - Cellule staminali embrionali in embrioni
    - - Xenotrapianti
        
        Complesso Maggiore di Istocompatibilità permette riconoscimento organo producendo molecole slla superficie della cellula
        
        Rischio patogeni o retrovirus (es. PERV nei maiali)
      - Alimentari (es. salmone AquAdvantage con ormone della crescita)
      - Clonazione animale: asportare il nucleo da cellula uovo e sostituirlo con una cellula somatica
        
        (Wilmut, 1996) pecora Dolly: clonazione da nucleo cellula adulta
      - Cellule staminali: cellule non differenziate divisibili all'infinito
        
        Totipotenti: embrionali, tutto l'organismo
        
        Pluripotenti: tutti i tipi cellulari
        
        Staminali embrionali (blastocisti): distruzione blastocisti, forse non stesse caratteristiche in vitro, possibilità mutazioni
        
        Indotte: cellule "riconvertite" in iindifferenziate, medicina rigenerativa
        
        Multipotenti: tipi cellulari in risposta a segnali
        
        Staminali somatiche: senza danni, efficaci in funzione della cellula di partenza
        
        Unipotenti: un tipo
        
        Autologhe: dal paziente stesso
        
        Rigenereazione cornea con prelievo cellule del limbus
- - - - Cocchi: diplo, strepto e stafilo
      - Bacilli (bastoncello)
      - Spirilli e spirochete (a spirale)
      - Vibrioni (virgola)
    - - Sporigeni o asporigeni
      - Aerobi o anaerobi
    - - Parete: peptidoglicano (polisaccaridi+proteine)
        
        Gram +: peptidoglicano>> (violetto)
        
        Gram -: peptidoglicano<<+lipidi (rosso)
        
        violetto, alcol, rosso
    - - Cromosoma: DNA circolare a doppio filamento
        
        Geni
        
        Operoni: geni nello stesso processo, risposta veloce a stimoli
        
        Strutturali: struttura cellula o funzionamento
        
        Promotore: legame RNA polimerasi
        
        Operatore
        
        Repressori
        
        Corepressori (attiva, operone trp reprimibile, tipico di vie anaboliche)
        
        Induttore (disattiva, operone lac inducibile, vie cataboliche)
        
        Attivatori
        
        Terminatori
        
        Regolatori: repressori o attivatori
      - Plasmidi (piccoli, geni non essenziali)
    - - Composizione
        
        Arricchito (ceppi mutanti)
        
        Complessi: carne o lievito (piú colonie, tutti i nutrienti)
        
        Minimo: azoto e fosforo, vitamine e ioni (genotipo selvatico)
      - Consistenza
        
        Solido: piatre di Petri (agar)
        
        Provetta (liquido sterile)
    - - Coniugazione
        
        Fattore di feritilità F (plasmide replicato)
        
        Pili di F+: ponte citoplasmtico tra donatore e ricevente
        
        Hfr (raro, F integrato nel cromosoma)
        
        Ricombinazione cromosoma nella cellula ricevente (DNA in eccesso degradato)
        
        Formazione di plasmide con DNA cromosomico
        
        Plasmide R (resistenza antibiotici)
      - Transformazione : acquisizione DNA dal terreno e incorporato nel cromosoma o plasmide
        
        Clonaggio genico: aumentare la frequenza
        
        Spontaneamente quando i batteri si degradano
      - Trasduzione: DNA da batteriofago
        
        Generalizzata: durante il ciclo litico, frammenti di cromosoma batterico intrappolati nel capside (qualsiasi gene)
        
        Fagi trasducenti (non degradano cromosoma batterico, impacchettamento non specifico per DNA virale, geni devono ricombinarsi con cromosoma ricevente)
        
        Specializzata: durante distaccamento di batteriofagi lisogeni, con sè dei tratti di DNA
  - - - DNA: un cromosoma lineare (herpesvirus)
      - RNA: quasi sempre singolo filamento
        
        Retrovirus: trascrittasi inversa traduce RNA in cDNA
    - - Ciclo litico: DNA non integrato nel genoma, virioni liberati da lisi membrana plasmatica
      - Ciclo lisogeno: integrato nel genoma e riattivato a segnali
        
        Fagi temperati: profagi (virus) e batteri lisogeni (ospite)
        
        Innescato da agenti danneggianti l'acido nucleico
    - - Influenza: virus a RNA. Penetra per endocitosi e con RNA polimerasi, crea altri RNA virali e proteine
        
        Virus A (emmoglutinina (HA), neuraminidasi (NA)), B e C
        
        Evoluzione
        
        Deriva antigenica: Errori nella copia dell'RNA
        
        Spostamento antigenico: riassortimento ovvero diversi ceppi si mescolano
- - - - Gene: promotore, parte codificante, terminatore
        
        Costitutivi (housekeeping): trascritti in tutte le cellule sempre
        
        Tessuto-specifici
        
        Inducibili: attivati a determinati stimoli (es. heat shock protein, danno DNA o ormonali)
      - Fattori di trascrizione: guidano RNA polimerasi su sito iniziale
        
        Elica-ripiegamento-Elica (tipica procarioti): due segmenti α elica (uno è elica di riconoscimento) separati da ripiegamento β.
        
        Zinc finger: 30 amminoacidi a dito+alla base (Zn+ 4 amminoacidi). Legame debole->Molte strutture simultanee
        
        Omedominio: 60 amminoacidi, nei geni omeotici (sviluppo eucarioti). Codificata da DNA omeobox. Simile a elica-ripiegamento-elica
      - Sequenze regolatrici (enhancer): legano attivatori sul promotore, ripiegando cromatina per contatto enhancer-promotore per formare complesso di trascrizione. Efficiente anche fra geni lontani
      - 3 RNA polimerasi
        
        I (RNA ribosomiale)
        
        II (mRNA)
        
        III (tRNA e piccoli RNA)
  - - - Impedisce legame fattori di trascrizione
      - Attrae proteine repressori
      - Mantenuta nella divisione cellulare (memoria epigenetica): labile, dopo la fecondazione c'è un ondata di demetilazione
    - - Acetilazione degli Istoni (sulle code con acetiltransferasi e deacetilasi: Stimola trascrizione, indebolisce legame DNA-code
      - Metilazione degli istoni (con metiltransferasi e istone demetilasi): reprime trascrizione
- - - - Trasposoni compositi: parte centrale+2 sequenze di inserzione
        
        Trasposizione replicativa: copia-incolla
        
        Trasposizione non replicativa: taglia-incolla
      - Sequenze di inserzione: solo gene traspostasi
    - - intermedio a RNA->DNA con trascrittasi inversa