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TECNICHE ELETTROFORETICHE - Coggle Diagram
TECNICHE ELETTROFORETICHE
INTRODUZIONE
metodo basato su migrazione di particelle cariche in campo elettrico
hanno applicazione:
analitica: per determinare caratteristiche di pp (massa e pI)
preparativa: purificare e valutazione di purificazioni di pp
effettuata in
cella elettroforetica
con supporto di gel: sistema diviso da soluzione tampone con ioni
alimentatore che fornisce corrente continua tra elettrodi (anodo e catodo)
principi elettroforesi
vedi formulario
molecola in campo elettrico ha mobilità che dipende dal suo rapporto
carica/massa
=> maggiore rapporto maggiore è mobilità, quindi ioni piccoli con alta carica sono veloci
campo elettrico (vedi formulario)
tampone
≠ a seconda del gel
determina e stabilizza pH del supporto
influenza velocità di migrazione perchè mantiene costante stato di ionizzazione di molecole
condiziona in base a molarità: alta aumenta R diminuisce V, bassa campione diffonde facilmente
supporto-gel
elimina correnti connettivi e moti di diffusione a fine corsa mantenendo i separati in bande strette
può avere setaccio molecolare
gel agarosio: per acidi nucleici e pp (isoelettrofocalizzazione)
polimero lineare di unità di agarobioso, ovvero D-galattosio+3,6-anidro-L-galattosio
poliacrilammide: sequenziamento DNA e pp (sds-page, in condizioni native, isoelettrofocalizzazione, bidimensionale)
gel preparato con copolimerizzazione di acrilammide con agente caos-linker=bis-acrilamide
con catalisi radicalizza, APS iniziatore e TEMED (tetrametilendiammina) catalizzatore
% di acrilammide determina porosità gel
ELETTROFORESI SU AGAROSIO
per separazione di DNA in quanto lineare e non va bene setaccio molecolare
a pH neutro DNA negativo e migra verso anodo
sistema orizzontale
conc. agarosio 0,5-2 %
voltaggio variabile, tenendo conto del calore che esso genera
altre varianti sono: rapporto carica/massa, conformazione DNA, bromuro di etidio
bromuro di etidio
colorante fluorescente che intercala a DNA post elettroforesi (fino 590 nm)
in sua assenza: DNA circolare < DNA lineare < DNA superavvolto
preparazione
agarosio pesato e sciolto in tampone TAE (tris, acetato, EDTA) mediante bollitura
raffreddato a T<50° e versato in apparato di elettroforesi
ricavo pozzetti con pettine
campioni risospinsi in TAE con glicerolo e xilema cieanolo e blu di bromofenolo (coloranti), per visualizzare la corsa e stopparla
vaschetta riempita con tampone e collegata a alimentatore
fine corsa gel in etidio bromuro e visualizzato in uv, permette di risalire alla massa di DNA
https://www.youtube.com/watch?v=vq759wKCCUQ
SDS-PAGE
page: poliacrilammide gel elettroforesi
elettroforesi per pp in condizioni denaturanti
gel di poliacrilammide e SDS, detergente presente in gel, tampone di corsa, tampone del campione (sample buffer)
separazione secondo dimensioni di catene polipeptidiche
setaccio molecolare
SDS
sodium dodecil solfato
solvente forte con parziale azione denaturante
presente in tutti il sistema di elettroforesi
si lega a pp stechimetricamente e ne maschera le cariche, quindi acquisiscono stesso rapporto Q/m, ma le rende distinguibili secondo lunghezza (che riflette la massa) in quando ogni 2 aa si associa un SDS con carica -, quindi più lungo è più è negativo e migra
=> carica negativa proporzionale alle dimensioni
GEL
sistema discontinuo in due tipologie differenti per pH e porosità
stacking gel
:
gel di impaccamento
pori grandi per movimento pp
ph 6,8
4% acrilammide
compito di focalizzare le pp in unica banda compatta
running gel
:
gel di corsa
dimensioni pori ≠ a seconda di % di acrilammide che va da 6 a 21%
pH 8,8
gradiente di acrilammide per maggiore risoluzione di soluzioni con pesi molecolari simili
separa pp in base al peso molecolare con setaccio
caricamento: prima creo running gel con gradiente portandolo a volume con H2O, quindi polimerizzanti ed infine stacking gel evitando le bolle e per avere linea dritta uso alcool e H2O
https://www.youtube.com/watch?v=XUjLO-ek2C8
https://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4
campione
pp denaturate con SDS in sample buffer a 100° per 3'
sample buffer contiene:
SDS,
ßmercaptoetanolo che riduce ponti bisolfuro,
blu bromofenolo marcatore (670 Da),
glicerolo o saccarosio per appesantire campione
tampone di corsa
composizione:
TRIS: tampona le variazioni di pH e fornisce ioni Cl- che hanno mobilità maggiore
glicina: ioni glicinato carichi negativamente con mobilità inferiore a complessi SDS
SDS
isotacoforesi: dove c'è caduta conduttanza si ha accelerazione di migrazione
Nel buffer a pH 8,3 Gli carica - quindi migra a v1, con ordine mobilità nello stacking gel Gly<SDScomplex<CL-
arrivata a loading buffer e stacking gel pH 6,8 la Gly è quasi neutra ed è speciepiù lenta e Cl- più veloce, quindi il complex è racchiuso e compattato in banda sottile
inizio running gel pH8,8 quindi Gly isotacoforesi e supera complex, quindi pp rallentano e si ritrovano compattati al massimo, quindi inizia separazione molecolare per setaccio
coloranti
coomassie blu
si lega ad alcuni residui Arg, His, Lys, Tyr, Trp, Phe
limite risoluzione 100 ng
con acido acetico ed etanolo che denaturano pp e le fissano a supporto
gel viene colorato per qualche minuto e quindi decolorato con acetico/metanolo, che toglie colorante in eccesso non legato a pp
colorazione irreversibile
tempo: 40'
sempre con colonnina standard
silver staining
pp ossidate con dicromato di K, Ag+ lega pp ossidate e si converte in Ag metallico colorandole nero-marrone
fase di incubazione = sviluppo (come fotografia)
limite risoluzione 0,1 ng
tempo: 3 h
più preciso
densitometria
no coloraozione, ma permette stima quantitativa di pp in singole bande mediante densiometro, con scansione ogni picco sono una banda del gel
ELETTROFORESI IN CONDIZIONI NATIVE
sistema discontinuo con gel poliacrilammide in condizioni NON denaturanti
SDS assente in gel e tampone di corsa
migrazione per Q/m, quindi non per determinare peso molecolare
applicazioni
rivelazione e identificazione enzima con reazione substrato cromogenico
purificazione piccole quantità enzimi oligomerici
studi struttura e funzione di enzimi in forma natia
studio modificazioni covalenti come ponti bisolfuro, ma ne servono almeno 2
ci sono ≠ rivelatori cromogenici, come Coomassie blu, attività della lattasi o colorazione in negativo con attività ferrossidasica
ELETTROFORESI IN GRAIDENTE
sia in condizioni natie che SDS-page
running gel con gradiente di poliacrilammide
nella natia aiuta per elettroforesi all'equilibrio, quindi a stoppare pp in base alla massa (ma lungo), per massa molecolare di pp oligomeriche native
permette di separare pp con masse simili
IEF
isoelettrofocalizzazione
separa pp in base a valori di pI: pH=pI ho carica netta pari a zero quindi no mobilità
con gradiente di pH includendo nel gel anfoliti: acido acetico all'anodo e NaOH al catodo
quindi gradiente stabilito nella precorsa con anfoliti e carica elettrica
carico il campione che a seconda della carica netta migra fino a pH del pI (posso caricarlo in qualsiasi punto)
applicazioni
determino pI di pp
studio microeterogeneità di pp
separazione isoenzimi
diagnostica molecolare (ex. mutanti)
più efficiente della. natia con riconoscimento di modificazioni posttraduzionale, percepisce anche solo un ponte bisolfuro
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE
tecnica risultante di combinazione IEF+SDS-page
IEF
prima dimensione con separazione secondo pI all' interno di un tubo di vetro (oggi strip di ≠ pH che posso far correre in parallelo)
in condizioni:
native senza aggiunta di SDS
denaturanti: no SDS perchè mi annulla le cariche, ma posso aggiungere urea
SDS
seconda dimensione , avviene inserendo tubo di IEF, dopo averlo trattato con SDS e DTT riducente, orizzontalmente direttamente nel running gel con gradiente.
la seconda dimensione è a 90° dalla prima e non richiede stacking gel in quanto campione arrivata già compatto da prima dimensione
ultimo passaggio è isolamento e caratterizzazione di spot (non bande), con diverse colorazioni, da Coomassie a fosforescenza
applicazioni
seguire i cambiamenti nell’espressione di TUTTE
le pp espresse da un organismo, da un tessuto o da una cellula per:
identificare proteine con condizione fisiologica o mutazione
identificare le modificazioni post-traduzionali di proteine (es. fosforilazioni)
confrontare un tessuto normale con uno malato
analizzare gli effetti del trattamento con farmaci o tossine
studiare cambiamenti nella componente proteica nei diversi stadi del ciclo cellulare o durante l’apoptosi
caratterizzare pp post elettroforesi 2D
analisi che permettono di ottenere dati di sequenza parziale utilizzando uno dei seguenti metodi:
sequenziamento proteico diretto mediante degradazione di Edman
profili di masse peptidiche ottenute con le analisi di spettrometria di massa di un digerito proteico (forniscono un’impronta caratteristica della proteina)
determinazione di sequenza con la spettrometria di massa
queste informazioni vengono poi confrontate con le informazioni presenti in DATABASE per l’identificazione della macchia proteica stessa
in commercio sono disponibili vari software d’analisi