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TECNICHE CROMATOGRAFICHE - Coggle Diagram
TECNICHE CROMATOGRAFICHE
INTRODUZIONE
cromatografia è insieme di metodi che sfruttano fenomeni chimico-fisici per separare e identificare ≠ componenti di un miscuglio
meccanismo di base
data una sostanza sciolta in solvente, se a questo volume ne aggiungo uno uguale immiscibile al primo la sostanza si distribuisce nei due solventi in conc. che dipendono dalle caratteristiche dei solventi e della sostanza
principi separazione cromatografia
- coefficiente di distribuzione Kd (formulario)
- tutti i sistemi hanno una FASE STAZIONARIA e una FASE MOBILE
- due composti si separano se hanno Kd ≠
- sostanza totalmente esclusa: quando Kd=0, cioè sostanza tutta in fase mobilie (sguscia via)
- processo all'equilibrio: Kd=1 cioè sostanza si ripartisce equamente fra fase mobile e stazionaria
cromatogramma
- grafico che riporta concentrazione di una sostanza sottoposta a cromatografia (in funzione del tempo)
- area sottesa dai picchi proporzionale alla quantità di ogni singolo componente (scopo quantitativo)
, ossia alla fuoriuscita di ogni componente ho picchi diversi
Kd=1: la ripartizione avviene con divisione 1:1 fra fase mobile e stazionaria quindi nel tempo ottengo una curva gaussiana il cui picco corrisponde alla zona di mezzo in cui si ha max conc in fase mobile
-
Kd≠1: le curve sono più distanziate fra loro in base alla sostanza che fuoriesce, in base alle loro Kd
Kd sostanza:
- più è trattenuta in fase stazionaria
- più elevato tempo di ritenzione (vedi formulario)
Dopo molti equilibramenti, le distribuzioni che si instaurano mostrano che sostanza:
• si sposta seguendo la direzione della fase mobile,
• si accumula preferenzialmente nelle porzioni centrali
Le concentrazioni che si realizzano in ciascuna porzione dipendono ovviamente da Kd (preferenza fase mobile o stazionaria)
=> Kd simili non separate in maniera ottimale
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finalità
- analitiche: identificare composto
- preparative: purificazione composto di interesse
TIPI CROMATOGRAFIE
- su carta: fase stazionaria liquida legata a fibre di cellulosa della carta, fase mobile sale per capillarità
- TLC (su strato sottile): fase stazionaria legata a matrice, stratificata su vetro, plastica o metallo. fase mobile sale per capillarità
- su colonna: fase stazionaria attaccata a matrice, impaccata in colonna di vetro fase liquida passa per gravità o pompa
cromatografia su colonna
matrice
- elevata stabilità meccanica
- presenza di gruppi funzionali per il legame con la fase
stazionaria
- elevata capacità
- un ampio intervallo di dimensioni di particelle
- una porosità adatta
- essere fatta di materiale inerte (non deve
minimamente interferire con la separazione
cromatografica)
- agarosio (gel fil., cr. idrofobica, cr. scambio ionico, cr. di affinità)
- destrano (gel fil., cr. scambio ionico, cr. di affinità)
- cellulosa (cr. scambio ionico)
- poliacrilammide (gel fil., cr. di affinità)
- polistirene (cr. scambio ionico)
- silice (cr. di partizione, cr. di adsorbimento, HTPC,
- colonna: vetro, plastica, ... con fori estremità per non fuoriuscire matrice
- serbatoio fase mobile con valvola di iniezione
- sistema rilascio
- sistema identificazione composti
- registratore
- raccoglitore di frazioni
- impaccamento: fase stazionaria già legata a matrice, in forma gel o polvere viene inserita in colonna senza formazione di bolle (alterano il risultato)
- equilibramento: inserisco in colonna tampone, quindi metto in flusso almeno 5 volumi di colonna con fase mobile
- caricamento campione: caricato manualmente o con polpa peristaltica dopo aver rimosso fase mobile (non a secco)
- eluizione: a velocità costante, per gravità o pompa. Faccio uscire campione con analiti separati.
eluizione isocratica quando uso 1 solo solvente, altrimenti gradiente di diverse forme e diverse caratteristiche
- rivelazione e raccoglitore: analiti separati rilevati secondo proprietà (spettrofotometrici con celle a flusso continuo).
raccoglitori suddividono eluato in frazioni fisse di tempo o volume
https://www.youtube.com/watch?v=UmWMlKJAdSk
https://www.youtube.com/watch?v=Zke6xGhbbho
GEL FILTRAZIONE
- volume vuoto V0: spazio fra granuli del gel
- volume interno Vi: spazio interno ai granuli
- volume granuli Vg
uscita secondo le dimensioni:
- totalmente escluse: molecole più grosse dai pori, con quantità fase mobile pari a V0 e Kd=0
- totalmente incluse: molecole più piccole si equilibrano con intero volume liquido ed eluiscono V=V0+Vi e Kd=1
- molecole intermedie: valore Kd intermedio ed eluiscono in vari volumi
esiste limite inferiore (cut off) e superiore di esclusione
-
- processo di separazione basato su setaccio molecolare: matrice con canali interni di ø regolabile
- Raggio di Stokes: condizione di separazione delle molecole, proporzionale alla massa (per globulari)
- separazione di pp con 10^2 <massa<10^6 kDa
- eluizione socratica
applicazioni
- purificazione pp*
- determinazione massa mol. relativa, allestendo retta di taratura
- dissalazione con colonne Sephadex G-25 i sali vengono ritardati
- concentrazione con Sephadex G-25 richiama acqua e piccole molecole e si gonfia
2: det. massa mol.
- volume di eluizione è funzione lineare del logaritmo del peso molecolare (confronto massa-volume empirico)
- costruisco curva di calibrazione con proteine di forma simile e peso noto (BSA)
con proteine marker (catalani, aldolasi,...) carico in colonna e misuro tr o V, quindi ricavo cromatografia che poi confronto con pp non nota
- consente uso di pp in condizioni native
3: dissalazione
- pp ≠ per dimensione dai sali
- usato per cambiare buffer prima di reazione enzimatica (da con sali a senza sali)
- colonnine preimpaccate (PD10)
4: concentrazione
- composti con alto peso molecolare possono essere conc. per aggiunta di G-25 secca
- acqua e sostanze a basso peso assorbite da gel che si rigonfia
- gel rimosso con centrifugazione
matrice
- destrano-Sephadex-Sephacryl: polimero di glucosio con legami ß1,6
- agarosio-Sepharose-BioGel A: polimero di D-galattosio e 3,6-anidrido-1-galattosio
- poliacrilammide-BioGel P: polimero di acrilamide
CR. DI PARTIZIONE
- datata ed usata dai chimici
- matrice di silice con organocloro silano per immobilizzare fase stazionaria
- due tipi:
- fase normale: no biologia, fase staz più polare di fase mob (solvente organico), analiti diluiti in polarità crescente
- fase inversa: per sistemi automatizzati, fase staz meno polare di fase mob (che quindi può essere anche solvente acquoso, quindi per biologi), analiti diluiti in polarità decrescente
CR. DI ADSORBIMENTO
- prima cromatografia
- alcuni materiali solidi trattengono composti su superficie per interazioni deboli
- solvente di eluizione deve avere una polarità simile a quella dell’analita più polare contenuto nella miscela da separare.
- gli eluenti più usati sono:
- Alcoli, per analiti che contengono gruppi OH
- acetone o esteri, per analiti che presentano gruppi carbonilici
- idrocarburi (es. esano, eptano, toluene), per analiti non polari.
- molto utilizzata in HPLC.
CR. IDROFOBICA
- aggregazione delle molecole apolari in un ambiente polare.
- pp separate in base al grado di idrofobicità di
superficie
- fase stazionaria è costituita da una matrice di
agarosio che porta dei gruppi funzionali alchilici
(esile, ottile) o fenilici
- campione applicato con tampone altamente polare che aumenta interazioni gruppi idrofobici di superficie con fase staz
- gradiente da solvente polare a non polare secondo serie di Hofmeister (solitamente decrescente di ammonio solfato e crescente di etilenglicol
- richiede presenza di composti che provocano salting-out di pp, dopo precipitazione in ammonio solfato
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