cromatografia è insieme di metodi che sfruttano fenomeni chimico-fisici per separare e identificare ≠ componenti di un miscuglio

meccanismo di base
data una sostanza sciolta in solvente, se a questo volume ne aggiungo uno uguale immiscibile al primo la sostanza si distribuisce nei due solventi in conc. che dipendono dalle caratteristiche dei solventi e della sostanza

principi separazione cromatografia

• coefficiente di distribuzione Kd (formulario)
• tutti i sistemi hanno una FASE STAZIONARIA e una FASE MOBILE
• due composti si separano se hanno Kd ≠
• sostanza totalmente esclusa: quando Kd=0, cioè sostanza tutta in fase mobilie (sguscia via)
• processo all'equilibrio: Kd=1 cioè sostanza si ripartisce equamente fra fase mobile e stazionaria
  

Dopo molti equilibramenti, le distribuzioni che si instaurano mostrano che sostanza:
• si sposta seguendo la direzione della fase mobile,
• si accumula preferenzialmente nelle porzioni centrali
Le concentrazioni che si realizzano in ciascuna porzione dipendono ovviamente da Kd (preferenza fase mobile o stazionaria)
=> Kd simili non separate in maniera ottimale

Kd sostanza:

• più è trattenuta in fase stazionaria
• più elevato tempo di ritenzione (vedi formulario)

risoluzione: indicice di quantità di sovrapposizione tra due picchi ed indica successo di separazione

risoluzione del picco Rs (vedi formulario) ha valore pari ad 1, ovvero separazione circa 98%, per cui la risoluzione ottimale prevede picchi non sovrapposti o se sovrapposti distinguibili

selettività

• misura capacità di discriminare tra due composti correlati x struttura
• capacità del sistema di fluire specie chimiche ≠ con vel. che escano separate
• fattore di separazione (vedi formulario)
• deve essere > 1,2, dipende dal meccanismo di separazione

capacità: misura di quantità di materiale che può essere risolta senza sovrapposizione picchi (cromatofocusing e scambio ionico)

efficienza

• misura di diffusione che provoca allargamento dei picchi e loro sovrapposizione
• capacità sistema di fare picchi stretti, cioè eluire specie con stessa caratteristica a stessa velocità
• misurata con larghezza base del picco (w)

≠ tipi di equilibrio

1. ad assorbimento (cr. di adsorbimento, cr. idrofobia)
2. di partizione (cr. pratizione, cr. fase inversa)
3. scambio ionico (cr. scambio ionico, cromatofocusing)
4. equilibrio fase stazionaria porosa e fase liquida mobile (gel filtrazione)
5. tra ligando immobilizzato e fase mobile liquida (cr. di affinità)
   

finalità

• analitiche: identificare composto
• preparative: purificazione composto di interesse

1. colonna: vetro, plastica, ... con fori estremità per non fuoriuscire matrice
2. serbatoio fase mobile con valvola di iniezione
3. sistema rilascio
4. sistema identificazione composti
5. registratore
6. raccoglitore di frazioni

1. elevata stabilità meccanica
2. presenza di gruppi funzionali per il legame con la fase
   stazionaria
3. elevata capacità
4. un ampio intervallo di dimensioni di particelle
5. una porosità adatta
6. essere fatta di materiale inerte (non deve
   minimamente interferire con la separazione
   cromatografica)

• agarosio (gel fil., cr. idrofobica, cr. scambio ionico, cr. di affinità)
• destrano (gel fil., cr. scambio ionico, cr. di affinità)
• cellulosa (cr. scambio ionico)
• poliacrilammide (gel fil., cr. di affinità)
• polistirene (cr. scambio ionico)
• silice (cr. di partizione, cr. di adsorbimento, HTPC,

molecole eluite in ordine di massa decrescente

uscita secondo le dimensioni:

1. totalmente escluse: molecole più grosse dai pori, con quantità fase mobile pari a V0 e Kd=0
2. totalmente incluse: molecole più piccole si equilibrano con intero volume liquido ed eluiscono V=V0+Vi e Kd=1
3. molecole intermedie: valore Kd intermedio ed eluiscono in vari volumi
   esiste limite inferiore (cut off) e superiore di esclusione

• processo di separazione basato su setaccio molecolare: matrice con canali interni di ø regolabile
• Raggio di Stokes: condizione di separazione delle molecole, proporzionale alla massa (per globulari)
• separazione di pp con 10^2 <massa<10^6 kDa
• eluizione socratica

matrice

• destrano-Sephadex-Sephacryl: polimero di glucosio con legami ß1,6
• agarosio-Sepharose-BioGel A: polimero di D-galattosio e 3,6-anidrido-1-galattosio
• poliacrilammide-BioGel P: polimero di acrilamide

2: det. massa mol.

• volume di eluizione è funzione lineare del logaritmo del peso molecolare (confronto massa-volume empirico)
• costruisco curva di calibrazione con proteine di forma simile e peso noto (BSA)
  con proteine marker (catalani, aldolasi,...) carico in colonna e misuro tr o V, quindi ricavo cromatografia che poi confronto con pp non nota
• consente uso di pp in condizioni native

3: dissalazione

• pp ≠ per dimensione dai sali
• usato per cambiare buffer prima di reazione enzimatica (da con sali a senza sali)
• colonnine preimpaccate (PD10)

4: concentrazione

• composti con alto peso molecolare possono essere conc. per aggiunta di G-25 secca
• acqua e sostanze a basso peso assorbite da gel che si rigonfia
• gel rimosso con centrifugazione

CR. DI PARTIZIONE

• datata ed usata dai chimici
• matrice di silice con organocloro silano per immobilizzare fase stazionaria
• due tipi:

1. fase normale: no biologia, fase staz più polare di fase mob (solvente organico), analiti diluiti in polarità crescente
2. fase inversa: per sistemi automatizzati, fase staz meno polare di fase mob (che quindi può essere anche solvente acquoso, quindi per biologi), analiti diluiti in polarità decrescente

CR. DI ADSORBIMENTO

• prima cromatografia
• alcuni materiali solidi trattengono composti su superficie per interazioni deboli
• solvente di eluizione deve avere una polarità simile a quella dell’analita più polare contenuto nella miscela da separare.
• gli eluenti più usati sono:

1. Alcoli, per analiti che contengono gruppi OH
2. acetone o esteri, per analiti che presentano gruppi carbonilici
3. idrocarburi (es. esano, eptano, toluene), per analiti non polari.

• molto utilizzata in HPLC.

CR. IDROFOBICA

• aggregazione delle molecole apolari in un ambiente polare.
• pp separate in base al grado di idrofobicità di
  superficie
• fase stazionaria è costituita da una matrice di
  agarosio che porta dei gruppi funzionali alchilici
  (esile, ottile) o fenilici
• campione applicato con tampone altamente polare che aumenta interazioni gruppi idrofobici di superficie con fase staz
• gradiente da solvente polare a non polare secondo serie di Hofmeister (solitamente decrescente di ammonio solfato e crescente di etilenglicol
• richiede presenza di composti che provocano salting-out di pp, dopo precipitazione in ammonio solfato

separazione in base la carica netta delle pp (che dipende dal pKa della molecola e dal pH della
soluzione), quindi due parametri di controllo: pH tampone mobile e pKa

pp carica + se pH<pI e carica - se pH>pI

si dividono in;

• scambiatori carbonici: carica - scambiano cationi
• scambiatori anionici: carica + scambiano anioni
  
  
  

• scambiatori forti: tot ionizzatili a tutti valori di pH (sultanato SO3- e anonimo quaternario)
• scambiatori deboli: ionizzabili solo a ristretto range di pH (ione carbossilato COO- e dietilammonio)

meccanismo
si realizzano 2 scambi ionici

1. cariche fase stazionaria neutralizzate da controione Cl-, quindi impaccamento in colonna, equilibrata senza cariche
2. caricamento campione: pp cariche. passaggio limitante
3. primo scambio ionico: pp con carica netta opposta a fase stazionaria scalzano controione
4. eluizione di pp con carica netta uguale a fase stazionaria Kd=0
5. secondo scambio ionico: eluizione pp legate che vengono scalzate da controioni che vengono immessi in gradiente di conc (forza ionica) oppure variando pH

matrici

• polistirene: monobeads, resistente
• agarosio
• destrano
• cellulosa

fase mobile

• pH e forza ionica di primo tampone devono favorire primo scambio ionico
• pH tampone varia a seconda della pp: superiore o inferiore di un unità rispetto a pI
• tamponi cationici come Tris, Piridina e alchilammine,
  vengono usati con gli scambiatori anionici
• tamponi anionici come acetato, barbiturato e fosfato
  vengono usati con gli scambiatori cationici

• applicazione di cromatografia a scambio ionico, quindi con stesse componenti
• pp separate secondo il punto isoelettrico (applicazione analitica)
• creato gradiente di pH sfruttando capacità tampone di scambiatore ionico
• colonna equilibrata con estremi di pH: prima equilibrio a pH superiore, quindi faccio flussare eluente con anfoliti e pH inferiore, creando quindi gradiente
• gradiente permette effetto di focalizzazione di pp al punto di pH=pI

effetto di focalizzazione

• pp migra velocemente fino a raggiungere pH=pI, superato il quale si fissa a fase stazionaria
• gradiente di pH in minuendo provoca nuovamente il distacco di pp e di nuovo il suo flusso fino a raggiungere nuovamente pH=pI
  => pp escono gradualmente secondo il gradiente, questo comporta elevata capacità: due aliquote ≠ anche caricate contemporaneamente

• non sfrutta interazioni chimico fisiche bensì interazioni biologiche specifiche => legami ad alta attività
• specificità di interazioni derivano da tipi diversi non covalenti
• tipo di cromatografia più selettivo e più recente
• primo passaggio in purificazione di pp a an

matrice

• assolutamente inerte
• gruppi chimici adatti e in # sufficiente per legame covalente con ligando
• stabile in condizioni di legame post eluizione
• minimizzare adsorbimento specifico
• con buone proprietà di flusso

braccio spaziatore

• molecola che distacca ligando-matrice
• aumenta efficienza di legame
• di 6-8 atomi C, non di meno per inefficacia ne di più perchè può interagire
• idrofilico o idrofobo
• con 2 gruppi chimici di legame: uno per matrice ed uno per coupling del ligando
• per macromolecole non necessario

ligando

• molecola che lega specificamente e reversibilemente pp
• con gruppi chimici modificabili per attacco a matrice
• Kd compresa fra 10^-4 e 10^-8 M perchè altrimenti interazione con pp troppo debole o troppo forte
• specificità assoluta per un solo composto o per gruppo ristretto (selettività di gruppo)
• fornite già con matrice o in lab si svolge copling: attacco covalente ligando-matrice

per evitare degradazione pp eterologhe e purificarle vengono prodotte come pp di fusione con pp stabile in organismo ospite

esempio: pGEX

• vettore di espressione di proteine di fusione con GTS
• di origine applicativa come antibiotici
• espressione sotto controllo di promotore tac, indotto da analogo del lattosio IPTG
• permette espressione di pp di fusione con sito di taglio per proteasi di precisione, ingegnerizzata con optimum di attività a 4° e prodotta come pp di fusione di GST
• può avere ≠ siti di taglio con ≠ polilinker e ≠ promotori

• metodo chimico applicato in biologia con FPLC
• per effettuare separazioni cromatografiche a pressioni > 5 MPa
• elevato potere risolutivo riducendo HETP, poiché vengono ottimizzati valori di Van Deemter:

1. particelle molto piccole e regolari della matrice riducono A
2. velocità di flusso elevata diminuisce B
3. sempre piccole dimensioni di particelle aumentano sup disponibile per equilibramento, quindi minore C

essendo elevata v di flusso le particelle piccole (5-3 µm) offrono > resistenza creando contropressione elevata, per questo si usano elevate pressioni di contrasto

vantaggi

• risparmio solvente

• sensibliltà

• riduzione tempi analisi
• con piccole quantità di campione
• assenza assoluta di diffusione longitudinale, quindi migliore risoluzione

• sistema più recente specifico per le pp
• computerizzato e veloce (15-20 min)
• pressioni intermedie fino a 4Mpa
• stessa struttura di HPLC ma con rivelatore uv-visibile a 280 nm
• particelle minori quindi si ottimizza equazione Van Deemter