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SPETTROFOTOMETRIA - Coggle Diagram
SPETTROFOTOMETRIA
S. UV-VISIBILE
tecnica analitica che permette di ricavare proprietà delle pp., a riconoscerne concentrazione, funzione ed attività
-
SPETTROFOTOMETRO
- sorgente luminosa: tungsteno-visibile, deuterio-uv
- monocromatore: sistema seleziona radiazione monocromatica
- compartimento del campione
- rivelatore: fotocelle o fotomoltiplicatori, convertono quanti in energia elettrica
monocromatore
- inizialmente prisma: con fessura in posizioni ≠ in base alla lunghezza d'onda necessaria (angoli incidenza e rifrazione comportano la separazione di componenti colorate MONOCROMATICHE)
- oggi reticolo di diffrazione: una o più fenditure con diffrazione creando interferenze, oppure le diverse lambda rimbalzano su piano ruvido quindi si ha riflessione con interferenza
- non sono dispositivi perfetti: fenditure limitano il range di lambda, ma ugualmente rimangono degli spettri, questo comporta minore potenza radiante
- filtri: selezione limitata di lambda e spettri comunque larghi, quindi di bassa qualità
stray light
luce esterna che arriva al fotomoltiplicatore, può compromettere le misure. identificabile perché la curva fra assorbanza e assorbanza dello strumento è lineare
sorgente
- produce luce POLICROMATICA in visibile o uv
- per visibile: lampade a incandescenza di filamento di tungsteno
- per uv: lampade a deuterio
- possibilità di averle entrambe, ricambiate con meccanismo interno a valore 340 nm
cuvetta
- pareti trasparenti per consentire passaggio della luce
- campione inserito in soluzione da analizzare
- vetro non trasparente per uv, quindi uso quarzo (SiO2)
- due facce ottiche e due facce ruvide per la manipolazione da parte dell'operatore
forotomoltiplicatore
- effetto fotoelettrico. fotoni incidenti su metallo provocano emissione di elettroni la cui energia è proporzionale a frequenza dei fotoni e il cui numero è prop. all' intensità luminosa
- sistema di diodi: amplifica la corrente generata con effetto fotoelettrico per essere misurabile nello spettro
tipologie
- a singolo raggio: due misurazioni, la prima con cuvetta di riferimento (bianco), successivamente quella con campione quindi differenza fra le due successivamente
- a doppio raggio: raggio diviso in due parti da specchi dopo monocromatore, quindi una parte a bianco e una a campione in contemporanea. Quindi assorbanza finale risultante è già differenza fra i due raggi
formulario:
- TRASMITTANZA
- ASSORBANZA
- LEGGE LAMBERT-BEER
- COEFFICENTE DI ESTINZIONE MOLARE
applicazione
- lambda COSTANTE: dosaggi enzimatici (determ. quantitative), determinazione di concentrazione proteica
- lamda VARIABILE: analisi qualitativa come identificazione di composti, spettri differenziali (sottraggo uno spettro ad un altro)
DICROISMO CIRCOLARE
polarizzazione circolare
- estremo del vettore campo elettrico descrive una circonferenza nel tempo
- due direzioni: sinistrorsa-antioraria e destrorsa-oraria
- nel piano la luce polarizzata è somma dei due vettori, con risultate una radiazione polarizzata che oscilla in un piano perpendicolarmente alla direzione di propagazione
- tecnica che usa polarizzazione circolare
- luce pol. passa in soluzione otticamente attiva, così da assorbire differentemente le due componenti (sx, dx) diversamente
=> è la differenza di assorbimento tra luce assorbita destrorsa e quella sinistrorsa ad una determinata lambda
luce polarizzata ellitticamente
- i vettori dx e sx hanno quindi dimensioni differenti la cui risultante quindi si presenta come un ellisse
- questo perchè interazione con sostanza porta a due differenti coefficienti di assorbimento delle due componenti
- rapporto tra asse maggiore e asse minore =tangente angolo: ELLITTICITA', la quale è direttamente proporzionale al dicroismo
vedi formulario
spettrofotometro per dicroismo
- bagnetto termostatico per vedere andamento pp in T
- nel vuoto con azoto perchè ossigeno può alterare misure
- radiazione polarizzata linearmente e successivamente passa per modulatore che rilascia alternativamente luce sinistrorsa e luce destrorsa
- radiazione attraversa campione e va a fotomoltiplicatore
- nel tempo vario le lambda così da ottenere uno spettro
interazione con pp
- luce pol. circolarmente interagisce con pp a livello delle transizioni
- n->π* 220 nm, conivolge elettroni non di legame di O caribonile
- π->π* 190 nm, coinvolge elettroni π carbonelle
=> intensità ed energia delle transizioni dipendono da angoli
fra C alfa e C, N
- dicroismo nel lontano uv (190-250 nm) dà informazioni sulla struttura secondaria
- standard: poly-L-Lys con 3 diverse conformazioni in base al pH (random- 7.0, elica-10.8, foglietto-11.1 post riscaldamento a 52° e raffreddamento)
- nel vicino uv (250-300 nm) danno info su struttura terziaria di pp, per assorbimento di aa aromatici e ponti disolfuro (ad alte conc.)
Random coil: positivo a 212 nm
negativo a 195 nm
b-sheet: positivo a 195 nm
negativo a 218 nm
a-elica: positivo a 192 nm
negativo a 209 nm
negativo a 222 nm
pp globulari
- hanno ≠ strutture secondarie quindi spettri modificati
- per dedurne quale sia la struttura secondaria principale faccio confronto con standard
- indagine più qualitativa che quantitativa
studio di cambiamenti conformazionali di macromolecole
- Determinare se una proteina è strutturata o meno
- Confrontare le strutture di proteine estratte da specie diverse oppure di mutanti della stessa proteina
- Studiare la stabilità conformazionale di una proteina in funzione di diversi parametri (temperatura, pH, denaturanti), solo se folding reversibile posso calcolare parametri cinetici
- Determinare se l’interazione con altre proteine induce dei cambiamenti conformazionali in una proteina
SPETTROFLUORIMETRIA
principio fluorescenza
- a seguito di eccitazione da radiazione luminosa, energia viene rimessa come radiazione, invece di essere convertita in calore
- fluorescenza è fenomeno di emissione
- la lamda emessa è sempre maggiore (energia minore) di quella assorbita e la differenza fra le due onde è nota come shift di Stokes
- ottengo sia spettro di eccitazione che di assorbimento, quindi posso anche fare un confronto
diagramma Jablonski
- quando molecola eccitata torna a stato fondamentale mette un fotone, quindi fluorescenza
- lo stato singoletto eccitato è meno stabile in quanto porta anche ad un inversione di spin, il ritorno allo stato fondamentale è più lento e porta a fosforescenza
- lo stato tripletto non ha inversione di spid ed è più veloce, porta a fluorescenza
fluorimetro
- lampada: lampada xenon o mercurio o laser, che favoriscono alta intensità in uv-visibile
- monocromatore di eccitazione
- PMT riferimento e PMT segnale
- sistemi di lenti
- campione: in cuvetta con 4 facce ottiche
- monocromatore di emissione a 90° rispetto alla lampada
- monocromatore di emissione perchè la luce rimessa è sempre in spettro quindi devo selezionare una lamda
- posizione a 90 ° perchè la luce è maggiormente assorbita e rimessa nella stessa direzione della fonte luminosa, a differenza dell'emissione fluorescente che è meno intensa
applicazioni
- lamda COSTANTE: dosaggi enzimatici, studi metabolici (NADH, NADPH sono fluorescenti)
- lamda VARIABILE: identificazione sostanza nota, studi di struttura pp
fluorofori
- fluorofori hanno tipicamente sistemi di doppi legami
coniugati o sono composti aromatici con elettroni p
delocalizzati (nelle pp triptofano e tirosina) - *fluorofori
intrinseci*
- analisi di composti non fluorescenti può essere effettuata accoppiandoli con sonda fluorescente - fluorofori estrinseci
- esempi: bromuro d' etidio per DNA, ANS con pp, 4-metil-umbelliferone che si lega con legame estere ad altra molecole, quindi S artificiale
- fluorofori si attivano con pp grazie a legami covalenti
vantaggi e svantaggi
- specificità e maggiore sensibiltà
- impossibilità di sapere se composto fluorescente, sensibilità a pH e T, smorzamento (queching): riassorbimento dell'emissione
GFP E BIOLUMINESCENZA
-
luminometria
- fenomeno di luminescenza: emissione di radiazione elettromagnetica in regione del visibile
- chemioluminescenza: emissione luce post reazione chimica
- bioluminescenza: emissione luce post reazione enzimatica
- esempio: luciferasi (e equorina):
- luciferina reagisce con ATP, ottengo luciferil adenilato
- prodotto odaisato a ossiluciferina con emissione luce
- ossilluciferina resintetizzata in luciferina
Usato dalle lucciole per dosare ATP