SPETTROFOTOMETRIA

S. UV-VISIBILE

tecnica analitica che permette di ricavare proprietà delle pp., a riconoscerne concentrazione, funzione ed attività

radiazione elettromagnetica

  • forma di energia capace di propagarsi nel vuoto, velocità di radiazione (c) ~ 3x10^10 cm/sec
  • composta da vettore elettrico + vettore magnetico, perpendicolari fra loro ed oscillano su piani ortogonali a direzione di propagazione
  • interazione radiazione con la materia è un fenomeno quantistico, quindi materia assorbe energia in quanti in base alla sua composizione atomica (transizioni)
  • frequenza: numero oscillazioni al sec. (Hertz)
  • periodo: tempo di un ciclo
  • lunghezza d'onda (lambda): distanza fra due punti consecutivi di ugual fase di un' onda (cm)
  • intensità: altezza onda (joules)

interazioni radiazione-materia

  • riflessione: onda respinta da superifice su cui incide
  • rifrazione: quando raggio luce incidente si idivdii in due raggi, uno riflesso ed uno trasmesso
  • diffusione: radiazione incidente riemessa in direzione +- casuale
  • diffrazione: luce attraversa fenditura, quindi propagazione non solo dritta, ma si espande nello spazio, comprendo regione maggiore della fenditura
  • interferenza: si verifica con onde in fase per cui si presenta interferenza costruttiva, se inde si sovrappongono per lambda ma non I, distruttiva onde sono fuori fase, quindi si crea onda con fase intermedia meno alta
  • polarizzazione: vibrazione del vettore elettrico giace su un solo piano, se tale radiazione attraversa soluzione con molecole otticamente attive si ha deviazione del piano di polarizzazione (polarimetria e dicroismo circolare)

diagramma Jablonski

  • rappresentazione del livello energetico di una molecola
  • ad ogni livello elettronico possono essere associati più livelli vibrazionali, e a casciano livelli rotazionali => spettro è una banda
  • i livelli di energia sono quantizzati: viene assorbita solo energia equivalente a differenza fra livelli energetici
  • energia di quanto (vedi formulario)

assorbimento
molecole vengon eccitate con radiazione elettromagnetica e ritornano allo stato fondamentale rimettendo tutta o parte dell'energia in energia termica

SPETTROFOTOMETRO

  • sorgente luminosa: tungsteno-visibile, deuterio-uv
  • monocromatore: sistema seleziona radiazione monocromatica
  • compartimento del campione
  • rivelatore: fotocelle o fotomoltiplicatori, convertono quanti in energia elettrica

monocromatore

  • inizialmente prisma: con fessura in posizioni ≠ in base alla lunghezza d'onda necessaria (angoli incidenza e rifrazione comportano la separazione di componenti colorate MONOCROMATICHE)
  • oggi reticolo di diffrazione: una o più fenditure con diffrazione creando interferenze, oppure le diverse lambda rimbalzano su piano ruvido quindi si ha riflessione con interferenza
  • non sono dispositivi perfetti: fenditure limitano il range di lambda, ma ugualmente rimangono degli spettri, questo comporta minore potenza radiante
  • filtri: selezione limitata di lambda e spettri comunque larghi, quindi di bassa qualità

stray light
luce esterna che arriva al fotomoltiplicatore, può compromettere le misure. identificabile perché la curva fra assorbanza e assorbanza dello strumento è lineare

sorgente

  • produce luce POLICROMATICA in visibile o uv
  • per visibile: lampade a incandescenza di filamento di tungsteno
  • per uv: lampade a deuterio
  • possibilità di averle entrambe, ricambiate con meccanismo interno a valore 340 nm

cuvetta

  • pareti trasparenti per consentire passaggio della luce
  • campione inserito in soluzione da analizzare
  • vetro non trasparente per uv, quindi uso quarzo (SiO2)
  • due facce ottiche e due facce ruvide per la manipolazione da parte dell'operatore

forotomoltiplicatore

  • effetto fotoelettrico. fotoni incidenti su metallo provocano emissione di elettroni la cui energia è proporzionale a frequenza dei fotoni e il cui numero è prop. all' intensità luminosa
  • sistema di diodi: amplifica la corrente generata con effetto fotoelettrico per essere misurabile nello spettro

tipologie

  • a singolo raggio: due misurazioni, la prima con cuvetta di riferimento (bianco), successivamente quella con campione quindi differenza fra le due successivamente
  • a doppio raggio: raggio diviso in due parti da specchi dopo monocromatore, quindi una parte a bianco e una a campione in contemporanea. Quindi assorbanza finale risultante è già differenza fra i due raggi

formulario:

  • TRASMITTANZA
  • ASSORBANZA
  • LEGGE LAMBERT-BEER
  • COEFFICENTE DI ESTINZIONE MOLARE

applicazione

  • lambda COSTANTE: dosaggi enzimatici (determ. quantitative), determinazione di concentrazione proteica
  • lamda VARIABILE: analisi qualitativa come identificazione di composti, spettri differenziali (sottraggo uno spettro ad un altro)

DICROISMO CIRCOLARE

polarizzazione circolare

  • estremo del vettore campo elettrico descrive una circonferenza nel tempo
  • due direzioni: sinistrorsa-antioraria e destrorsa-oraria
  • nel piano la luce polarizzata è somma dei due vettori, con risultate una radiazione polarizzata che oscilla in un piano perpendicolarmente alla direzione di propagazione
  • tecnica che usa polarizzazione circolare
  • luce pol. passa in soluzione otticamente attiva, così da assorbire differentemente le due componenti (sx, dx) diversamente
    => è la differenza di assorbimento tra luce assorbita destrorsa e quella sinistrorsa ad una determinata lambda

luce polarizzata ellitticamente

  • i vettori dx e sx hanno quindi dimensioni differenti la cui risultante quindi si presenta come un ellisse
  • questo perchè interazione con sostanza porta a due differenti coefficienti di assorbimento delle due componenti
  • rapporto tra asse maggiore e asse minore =tangente angolo: ELLITTICITA', la quale è direttamente proporzionale al dicroismo
    vedi formulario

spettrofotometro per dicroismo

  1. bagnetto termostatico per vedere andamento pp in T
  2. nel vuoto con azoto perchè ossigeno può alterare misure
  3. radiazione polarizzata linearmente e successivamente passa per modulatore che rilascia alternativamente luce sinistrorsa e luce destrorsa
  4. radiazione attraversa campione e va a fotomoltiplicatore
  5. nel tempo vario le lambda così da ottenere uno spettro

interazione con pp

  • luce pol. circolarmente interagisce con pp a livello delle transizioni
  • n->π* 220 nm, conivolge elettroni non di legame di O caribonile
  • π->π* 190 nm, coinvolge elettroni π carbonelle
    => intensità ed energia delle transizioni dipendono da angoli
    fra C alfa e C, N
  • dicroismo nel lontano uv (190-250 nm) dà informazioni sulla struttura secondaria
  • standard: poly-L-Lys con 3 diverse conformazioni in base al pH (random- 7.0, elica-10.8, foglietto-11.1 post riscaldamento a 52° e raffreddamento)
  • nel vicino uv (250-300 nm) danno info su struttura terziaria di pp, per assorbimento di aa aromatici e ponti disolfuro (ad alte conc.)

Random coil: positivo a 212 nm
negativo a 195 nm


b-sheet: positivo a 195 nm
negativo a 218 nm


a-elica: positivo a 192 nm
negativo a 209 nm
negativo a 222 nm

pp globulari

  • hanno ≠ strutture secondarie quindi spettri modificati
  • per dedurne quale sia la struttura secondaria principale faccio confronto con standard
  • indagine più qualitativa che quantitativa

studio di cambiamenti conformazionali di macromolecole

  • Determinare se una proteina è strutturata o meno
  • Confrontare le strutture di proteine estratte da specie diverse oppure di mutanti della stessa proteina
  • Studiare la stabilità conformazionale di una proteina in funzione di diversi parametri (temperatura, pH, denaturanti), solo se folding reversibile posso calcolare parametri cinetici
    • Determinare se l’interazione con altre proteine induce dei cambiamenti conformazionali in una proteina

SPETTROFLUORIMETRIA

principio fluorescenza

  • a seguito di eccitazione da radiazione luminosa, energia viene rimessa come radiazione, invece di essere convertita in calore
  • fluorescenza è fenomeno di emissione
  • la lamda emessa è sempre maggiore (energia minore) di quella assorbita e la differenza fra le due onde è nota come shift di Stokes
  • ottengo sia spettro di eccitazione che di assorbimento, quindi posso anche fare un confronto

GFP E BIOLUMINESCENZA

diagramma Jablonski

  • quando molecola eccitata torna a stato fondamentale mette un fotone, quindi fluorescenza
  • lo stato singoletto eccitato è meno stabile in quanto porta anche ad un inversione di spin, il ritorno allo stato fondamentale è più lento e porta a fosforescenza
  • lo stato tripletto non ha inversione di spid ed è più veloce, porta a fluorescenza

fluorimetro

  • lampada: lampada xenon o mercurio o laser, che favoriscono alta intensità in uv-visibile
  • monocromatore di eccitazione
  • PMT riferimento e PMT segnale
  • sistemi di lenti
  • campione: in cuvetta con 4 facce ottiche
  • monocromatore di emissione a 90° rispetto alla lampada
  • monocromatore di emissione perchè la luce rimessa è sempre in spettro quindi devo selezionare una lamda
  • posizione a 90 ° perchè la luce è maggiormente assorbita e rimessa nella stessa direzione della fonte luminosa, a differenza dell'emissione fluorescente che è meno intensa

applicazioni

  • lamda COSTANTE: dosaggi enzimatici, studi metabolici (NADH, NADPH sono fluorescenti)
  • lamda VARIABILE: identificazione sostanza nota, studi di struttura pp

fluorofori

  • fluorofori hanno tipicamente sistemi di doppi legami
    coniugati o sono composti aromatici con elettroni p
    delocalizzati (nelle pp triptofano e tirosina) - *fluorofori
    intrinseci*
  • analisi di composti non fluorescenti può essere effettuata accoppiandoli con sonda fluorescente - fluorofori estrinseci
  • esempi: bromuro d' etidio per DNA, ANS con pp, 4-metil-umbelliferone che si lega con legame estere ad altra molecole, quindi S artificiale
  • fluorofori si attivano con pp grazie a legami covalenti

vantaggi e svantaggi

  • specificità e maggiore sensibiltà
  • impossibilità di sapere se composto fluorescente, sensibilità a pH e T, smorzamento (queching): riassorbimento dell'emissione

GFP
green fluorescent protein

  • proteina di 238 aa termostabile isolata da medusa Aequoria victoria da Osamu Shimomura (nobel 2008)
  • trasduce energia di bioluminescenza blu dell' equorina
  • GFP ha permesso di sviluppare marcerà per localizzazione subcellulare di pp ricombinanti (come mitocondri introno cloroplasti)
  • struttura a cilindro con 11ß strands con piccola alfa elica alle estremità
  • in vivo: GFP lega complesso equorina, pp che quando lega Ca2+ emette bioluminescenza blu assorbita quindi da GFP (395-509 nm)
  • in vitro: usata per luce uv per eccitare fluoroforo di GFP con spettro nel verde

beta-can
struttura particolare di foglietti ß esterni e alfa eliche interne molto stabile e difficilmente degradabile

  • stabile ad attacco da proteasi, inoltre piccola quindi facile da duplicare
    -cromoforo all'interno della struttura, ma ≠ dagli altri:si forma spontaneamente ed è costituito da 3 aminoacidi adiacenti:
    Ser – Tyr – Gly
    che vengono rapidamente convertiti in un fluoroforo ciclico, che subisce una reazione di disidratazione (del legame peptidico tra Ser eTyr), seguita da un’ossidazione della Tyr (da parte di O2 atmosferico) che introduce un doppio legame

=> picco di emissione di GFP dipende da intorno proteico

M. Chaldie
trovò che GFP unica perchè richiede solo ossigeno per convertire luce UV in verde visibile.
Quindi comprese che si può usare GFP come TAG fluorescente a qualsiasi tipo di pp, inserendone il gene in siti specifici di dna (oggi molti plasmidi in commercio con sua sequenza)

R. Tsien
nel 1995 produsse mutante S65T che migliora caratteristiche di spettro di emissione con fluorescenza + stabile e + intensa
=> maneggiando l'introno ha creato una classe di pp fluorescenti usabili come tag (YFP, EBFP, EBFP2, citrine, Venus, etc.)

mutanti sono:

  • fotostabili
  • idrofilici
  • solubili
  • fluorescenti
  • vasta gamma di colori nel visibile
  • sempre stesso sluoroforo, cambia solo intorno

applicazioni

  • marcatore di pp
  • reporter di geni
  • localizzazione subcellulare
  • FRET: fluorescente resonance energy transfer, per studio interazione fra pp. Avviene trasferendo energia con risonanza di Forster a secondo cromoforo a distanza minore a 10 nm (se c'è trasferimento allora pp interagiscono)

luminometria

  • fenomeno di luminescenza: emissione di radiazione elettromagnetica in regione del visibile
  • chemioluminescenza: emissione luce post reazione chimica
  • bioluminescenza: emissione luce post reazione enzimatica
  • esempio: luciferasi (e equorina):
  1. luciferina reagisce con ATP, ottengo luciferil adenilato
  2. prodotto odaisato a ossiluciferina con emissione luce
  3. ossilluciferina resintetizzata in luciferina
    Usato dalle lucciole per dosare ATP