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DOSAGGIO PROTEICO - Coggle Diagram
DOSAGGIO PROTEICO
-
vedi formulario:
- MICHELIS E MENTEN
- IPOTESI HALDANE
- LINEARIZZAZIONE LINEWEAVER E BURK
- UNITA' ENZIMATICA
INIBIZIONI
saggi enzimatici condotti in:
- eccesso di S (10 vote Km)
- misurando la velocità iniziale
- pH e T costanti
- con retta di controllo
- eseguendo preincubazione a T di reazione
- analizzando diversi Vol di enzima
analizzando volumi diversi di enzima l'attività deve variare proporzionalmente, quindi raddoppiando enzima raddoppia anche pendenza della curva
≠ tecniche di misura
- spettrofotometriche
- fluorimetriche
- radioisotopiche
- cromografiche
- manometriche
- immunochimiche
TIPOLOGIE DI SAGGI
continui
- si segue attività enzimatica in continuo misurandone ∆E nel tempo
- S e P devono essere ≠ per proprietà misurabili come spettrofotometria
- la conc. di S e P monitorata costantemente (la seconda aumenta esponenzialmente la prima diminuisce logaritmicamente
- determinazione attività lattato deidrogenasi: misuro ossidazione del lattato misurando l'assorbimento di NADH a 340 nm (utilizzando reazione inversa, ma comunque mi da informazioni)
- substrati artificiali: quando ne S ne P sono misurabili allora uso S o P con proprietà misurabili, come 4-metil-embelliferone: composto fluorescente che lega con legame estere, quindi usato come S artificiale
discontinui
- aliquote della miscela di reazione vengono prelevate ad
intervalli di tempo. La reazione viene bloccata.
- dopo l’inattivazione dell’enzima ogni punto viene analizzato con la metodica scelta.
- occorre dimostrare la linearità del saggio nel tempo (velocità iniziale)
- esempio: dosaggio dell’attività RNAsica:
1.Incubazione RNA + RNAsi
- Precipitazione con sali di lantanio
- Lettura a 260 nm del SN
accoppiati
- si possono utilizzare quando ne’ substrati ne’ prodotti hanno caratteristiche rivelabili e misurabili
- si utilizza una seconda reazione, abbinata alla prima, che
possa dare una misura della prima
- esempio: dosaggio attività privato chinasica
- posso accoppiare ulteriori reazioni se le prime non mi danno risultati misurabili (enzima tralasci)
di inibizione
negli studi di inibizione enzimatica si varia sia la
concentrazione del substrato che quella dell’inibitore
La forza dell’inibizione è data dalla Ki