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2_ Cromatografia - Coggle Diagram

- - - - 1_ Anionici
        
        resina carica +
      - 2_ Cationici
        
        resina carica -
      - 1_ FORTI
        
        Sono acidi Forti
        
        Sono CARICHI a un range di pH più ampio
      - 2_ DEBOLI
        
        Cambia la QUANTITA' di CARICA a seconda del pH
  - - - è il valore di pH particolare, coincide con il valore di pH in cui questa molecola ha una carica elettrica Neutra
      - In ambienti
        
        Acidi =+
        
        Basici = -
    - - Proteina -
        
        Rilascia dei Contro Ioni (Acidi o basi deboli)
        
        Neutralizzano la Carica
        
        Risultato
        
        Variazioni Locali del pH e Forza Ionica
      - Matrice Scambiatore Anionico +
    - - Equilibrio tra
        
        pH Neutro e +
        
        Phosfato
        
        pH Neutro e -
        
        TRIS
      - DEVE ESSERE dello stesso segno dello scambiatore
        
        Non deve interferire
  - - - Campione esce concentrato
    - - xchè ha il pH LONTANO dal pka
    - - Calo della POLARITA del Eluente (> conc di SALE)
  - - - Basso SALE
      - TAMPONE ADEGUATO (conc, pH,carica)
    - - > con di SALE
        
        > Costante Dielettrica
        
        < Forza Elettrostatica
      - Forza Ionica
- - - - specificità = interazione ligando e la proteina
  - - - Secondo determinate condizioni sperimentali
    - - questo interagisce con la fase stazionaria
    - - Cambio le condizioni di binding:
        
        1_ Cambio della Polarità del Solvente
        
        2_ Uso di Agenti caotropici
        
        pH
        
        Forza Ionica
        
        3_ Agisco sul K = Acidifico il sistema indebolendo i legami
        
        4_ Imidazolo
        
        5_ Condizioni Denaturanti (che si basa sulla sequenza primaria e monodimensionale)
  - - - PROTEINA
        
        Ho la fase Stazionaria alla quale sono legate ioni ZINCO
        
        2 mol His (delle 6 His che abbiamo messo con la proteina)
        
        legame di Coordinazione
        
        dove 2 doppietti liberi sull'Azoto vengono condivisi con lo Ione Zn
        
        Eluizione
        
        > conc. Imidazolo
        
        Scalza la proteina e si coordina
        
        Uscita = PROTEINA
      - LIGANDO
        
        Si basa sull'affinità del Glutatione S-Transferasi per il Glutatione Ridotto
        
        Fase stazionaria alla quale è legato
        
        un Linker
        
        Glutatione Ridotto
        
        Proteina
        
        si lega, perchè riconosce ...
        
        Eluizione
        
        > con di Glutatione Ridotto
        
        scalza la Proteina
        
        non interagisce con la fase stazionaria
        
        USCITA = PROT+ LIGANDO
- - - - è da considerare anche la struttura chimica della molecola
  - - - Impedisce i legami tenui con alcune prot possono presentare sulla superficie delle Cisteine/met/His
- - - - hanno affinità per la porzione Fc degli anticorpi
  - - - SFRUTTO la funzione Ammidica, Carboammidica o Tiolica della prot
- - - - Abbiamo la proteina + tag fusa alla MaltoBinding Prot
    - - Abbiamo una resina di AMILOSIO
      - L'eluizione avviene mediante uso di MALTOSIO
      - Devo avere EDTA per il binding sia nel campione di binding/ eluizione
        
        EDTA è un chelante non è adatto a proteine che necessitano metalli pesanti
- - - - Nikel
        
        è esavalente (forma 6 legami )
        
        Sono atomi di O e N che condividono 2e con lo Ione Nikel
        
        poi rimangono 2 siti vaganti che vengono occupati da 2 mol H20
    - - n°2 His si legano hai 2 siti liberi scalzando le 2mol H20
        
        Quindi le Histidine devono trovarsi in determinate CONDIZIONI
        
        La catena laterale dell'His ha
        
        pka 6 1/2
        
        pH intermedio
        
        Ho la forma protonata in condizioni Acide
        
        Ho la forma Neutra in condizioni Basiche
        
        devo trovarmi in condizioni Basiche per avere le His nello stato neutro con il doppietto libero