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TECNICHE IMMUNOLOGICHE:ELISA (Può avvenire in due modi: (Diretto (si…
TECNICHE IMMUNOLOGICHE:ELISA
Nei test immunoenzimatici l'anticorpo è marcato con un enzima di cui si misura l'attività su uno specifico substrato attraverso la formazione di prodotti di reazione colorati che possono essere dosati spettrofotometricamente
E' il più diffuso e si basa sulla valutazione dell'attività di un enzima nei confronti del proprio substrato
Può avvenire in due modi:
Diretto
si introduce un anticorpo specifico che legherà il complesso anticorpo + antigene, formando un "terzo" strato (o "sandwich"), da cui prende il nome il test;
all'ultimo anticorpo che abbiamo aggiunto, è legato un enzima specifico, e aggiungendo il suo substrato si formerà un prodotto colorato, che evidenzierà il pozzetto nel caso in cui sia presente l'antigene di interesse;
in seguito si introduce l'antigene, che si legherà all'anticorpo. Si lava ulteriormente per togliere antigeni in eccesso o non legati;
Il metodo prevede la copertura del fondo del pozzetto con un anticorpo specifico per l'antigene che vogliamo misurare. Si esegue un lavaggio;
Indiretto
Ricerca specifici antigeni in un dato liquido biologico avendo a disposizione anticorpi marcati a cui questi possano legarsi o, al contrario, per ricercare specifici anticorpi avendo a disposizione anticorpi marcati che possano legarsi al frammento cristallizabile di questi ultimi.
Infine si aggiunge il substrato dell'enzima con cui è stato marcato l'anti-anticorpo:un cambiamento di colore indica la presenza degli antigeni nel campione.
si effettua un lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legatisi all'antigene (quelli combinati resistono invece al lavaggio);
si aggiunge l'anticorpo per l'antigene che probabilmente è stato adsorbito al fondo del pozzetto. Questo anticorpo è coniugato con un marcatore (tag) enzimatico, di norma fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi e si lava via l'eccesso ancora una volta;
Si copre il fondo del pozzetto con l'estratto proteico in cui potrebbe essere presente la proteina che vogliamo misurare (antigene) e si lava via l'eccesso per eliminare l'indesiderato;
Una conformazione innovativa della fase solida
Gli importanti vantaggi sono:
un'ogiva di ogni astina non è sensibilizzata e funge da controllo negativo, per valutare la specificità per tutti i test di ricerca di anticorpi e/o antigeni eseguiti nel campione in esame;
non si deve effettuare la distribuzione dei campioni, dei coniugati e del cromogeno nei pozzetti di micropiastra o in microstrip; i lavaggi sono estremamente semplificati;
il volume del campione analizzato può essere aumentato per aumentare la sensibilità del test in campioni clinici (sangue, saliva, urine), alimentari (latte di massa, pool di uova) e ambientali (acqua);
la tecnologia innovativa consente la realizzazione di kit da laboratorio pronti all'uso e di kit portatili per analisi in campo (ambulatori, aeroporti, dogane, allevamenti).
L'astina introdotta nel campione ha le ogive sensibilizzate con reagenti differenti, in modo che in ciascun campione sia possibile la ricerca simultanea di differenti anticorpi e/o di differenti antigeni, per analisi multiple o per multi-screening;
l’emissione chimiluminescente del prodotto di reazione enzimatica può essere captata ed analizzata da un luminografo, connesso ad un microscopio ottico, a sua volta interfacciato con un analizzatore computerizzato d’immagine che consente di evidenziare i segnali chemiluminescenti, guardandone l’intensità per mezzo di una scala di colori convenzionale.
Gli anticorpi sono coniugati con enzimi quali la perossidasi, la fosfatasi alcalina, la β-galattosidasi senza alterarne la capacità di combinazione con gli antigeni corrispondenti;
le reazioni enzimatiche possono essere impiegate per la ricerca di antigeni o anticorpi;
il legame degli anticorpi coniugati con l’enzima all’antigene viene svelato aggiungendo il substrato ed i reattivi necessari ad evidenziare l’attività dell’enzima, il quale per essere impiegato in una reazione di questo tipo deve essere in grado di catalizzare una reazione caratterizzata da un prodotto terminale colorato;
COME FUNZIONA: