Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

[Techno19] Microbiology assays (ปัจจัยที่ มีผลต่อการตรวจสอบทางจุลชีววิทยา…

- - - - แหล่งของเชื้อจุลินทรีย์ที่ใช้ทดสอบ
        
        แยกเชื้อมาจากแหล่ง
        : ต้องกำหนดstrains
        : แยกจากผู้ป่วยหรือเภสัชภัณฑ์ที่ปนเปื้อน
        
        จำนวนครั้งของการแยกเชื้อมาทดสอบ
        (the number of subculture / passages)
        : เนื่องจากแต่ละครั้งที่แยกเชื้อมาทดสอบเชื้อจะเกิด
        mutation, natural selection
        **ส่วนใหญ่ Subculture ไม่เกิด 5 ครั้ง
    - - สารต้านจุลชีพมักเป็ นกรดอ่อนหรือเบสอ่อน
        : lipid solubility (unionized form)
        ex Na benzoate แตกตัวในสภาวะกรด (อยู่ในรูป unionized form) จะซึมผ่านเข้าเชื้อ ไปทำลายเชื้อ
        : pH ของอาหารเลี้ยงเชื้อมีผลต่อ degree of ionization
      - สารอินทรีย์ที่กำหนดให้ใช้ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีในตัวอย่าง
        : เลือด ซีรัม หนอง
      - divalent และ trivalent cation
        : มีผลกับ tetrecycline และ aminoglycosides
    - - อุณหภูมิ - ระยะเวลา
        
        ความเข้มข้นเริ่มต้น
        : conc.สุดท้ายอาจสูงกว่า
        
        ความเข้มข้นของออกซิเจน
        : ถ้าออกซิเจนน้อยaminoglycosides (-mycin) มี ปสภ ต่ำลง
    - - ความเข้มข้นและลักษณะของเชื้อที่ใช้ทดสอบ (inoculum
        
        ลักษณะของinoculum
        
        : อายุของเชื้อ (ค.สามารถในการเจริญเติบโต)
        ✔️logarithmic growth phase : “young”
        ❌stationary phase : “old
        
        : การสร้างantibiotic inactivating enzyme
        
        : ความเหมาะสมกับอาหารเลี้ยงเ(susceptibility)
        Ex แบคทีเรีย (FT, SCDM), รา (SCDM, SDA
- - - - 1.3. antibiotic microbial assay / biological assay / bioassay
        
        bacterial growth inhibition (เทียบ ref std.)
        
        *จุดเด่น ไม่ถูกรบกวนจากinactive impurities
        (วิธี HPLC spectro มักมีข้อเสียคือถูกรบกวนจาก impure)
      - 1.2. enzyme-based and immunoassay
        
        antibiotic กับspecific enzyme
        
        kits : นิยมใช้ในโรงพยาบาลและใช้ตรวจสอบพิษจากยา ATB
      - 1.1. conventional chemical assay
        
        titration, spectrophotometry, HPLC
        
        นิยมใช้ในโรงงานอุตสาหกร
- - - - เป็นการทดสอบเทียบกับ ref std
        
        หน่วยแสดง ปสภ ขึ้นกับ ชนิดยา
        : unit, mcg/mL, a potency ratio
        
        มีการกำหนดเชื้อจำเพาะ
      - 2 วิธี
        
        1.1. Agar diffusion method / cylindrical plate / plate assay
        
        -ทำการทดลองในเพลท โดยวัดระยะทางการแพร่ของยาออกจากจุดกักยา(reservoir)
        
        -ความเข้มข้นของยาจะลดลงจากจA ไป B เป็นลำดับ
        -ช่วงA ถึงX เรียก inhibitory concentration
        (inhibition zone / clear zone)
        -ช่วงX ถึงB เรียก sub-inhibitory concentration
        -ณ จุดX (at the time, zone edge) เท่ากับมCIC
        : CIC = critical inhibitory concentration
        
        คำนวณ
        
        สร้างกราฟมาตรฐาน
        แล้วเทียบค่าที่ได้ของตัวอย่าง
        
        กราฟระหว่าง
        X = ความเข้มข้นของยา
        (สารมาตรฐาน)(IU/ml)
        Y = zone diameter (mm)
        
        OR สูตร potency ratio
        ทำเทียบกับสารมาตรฐาน
        Four-point agar diffusion assay of bacitracin
        
        Log X = LDR x (UH+UL) – (SH+SL)
        (SH-SL) + (UH-UL)
        S: standard U: unknown H: high dose L: low dose
        LDR : logarithm of the dose ratio
        (ratio of concentrations of standard solution)
        
        แกน X = log conc (IU/ml)
        แกน Y = inh zone diameter
        
        สิ่งที่ต้องคำนึง
        หน้า 19
        
        1.2. Turbidimetric method / tube assay
        **แม่นยำกว่า ไวกว่า ใช้เวลาน้อยกว่า
        
        สิ่งที่ต้องคำนึง
        หน้า 20
        
        วิธี
        
        Vary conc std(or sample) + agarเหลว + inoculum
        เพาะ => วัดความขุ่นด้วย spectro => สร้างกราฟมาตรฐาน
        
        คำนวณ
        
        แกน X = log conc. of std
        แกน Y :p= % transmittance
      - นิยม
        
        -ตำรับที่มี สปก ซับซ้อน
        -ตำรับที่มีสารที่เกิดจากการเสื่อม(breakdown product)
        -ส่วนที่สกัดออกจากตำรับยา
        -ตำรับที่มีไอโซเมอร์ เช่น neomycin, gentamicin
      - เตรียม
        
        การเตรียม stock & dilition ref
        
        สภาวะการเพาะเลี้ยง
        
        สายพันธ์:
    - - หลักการ
        
        หลักการเลือกเชื้อ
        
        ใช้เชื้อจุลิ5 สายพันธุ์
        
        Organism. Medium Incubation temp. Candida albicans (ATCC No. 10231) SDA/B 22.5 +/- 2.5 Aspergillus niger (ATCC No.16404) SDA/B 22.5 +/- 2.5 Escherichia coli (ATCC No. 8739) SCDA/B 32.5 +/- 2.5 Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027) SCDA/B 32.5 +/- 2.5 Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538) SCDA/B 32.5 +/- 2.5
        
        ต้องแยกจากoriginal ATCC
        culture ไม่ เกิน5 ครั้ง(passages)
        
        เติมเชื้อแบบแยกภาชนะบรรจุ
        
        อาจใช้เชื้อสายพันธุ์ที่เป็นปัญหา
        หรือปนเปื้อนในการผลิตครั้งก่อนๆ
        
        หลักการทดสอบ
        
        -ไม่ใช่การตรวจสอบปริมาณ(chemical assay) ของ preservative
        -ไม่ทดสอบกับตำรับที่ไม่มีpreservative
        
        -เป็นการทดสอบ ปสภ ของสารกันเสีย
        -ทดสอบกับ finished product
        -อาจถูกรบกวนจากตัวยาหรือสารช่วยอื่นใน(intrinsic activity)
        
        วิธีการทดสอบ
        
        sample + inoculum → incubation → inactivation → a viable count of inoculum
        -เป็ นการเติมเชื้อที่ทราบความเข้มข้นลงในตำรับ
        -แล้วนับจำนวนเชื้อที่รอดชีวิตหลังการเพาะเลี้ยง
        
        conc.sam ขึ้นกับประเภท
        : category 1, 2, 3 = ระหว่าง1x10^5ถึง1x10^6 cfu/mL
        : category 4 = ระหว่าง1x10^3 ถึง1x10^4 cfu/mL
        
        -สุ่มตัวอย่างจากแต่ละภาชนะบรรจุตามเวลาที่กำหนด
        -เติมสารหยุดปฏิกิริยา (neutralizing agent)
        และบันทึกผล
        
        เกณฑ์ ตามประเภทของตำรับ 4 ระดับ
        
        คำนวณ
        ถ้าปริมาณเชื้อเพิ่ม 0.5 log10หน่วย เมื่อเทียบกับค่าเริ่มต้นถือว่าไม่มีปริมาณเชื้อ
        
        สร้างกราฟlog reduction
        แกนX = Time of Exposure
        แกน Y = number of survivor(Log)
        
        ตรวจความเข้มข้นของเชื้อ(cfu/mL)
        ในแต่ละหลอดหลังการเพาะเลี้ยง
    - - วิธี5-5-5 testing
        
        : ใช้เชื้อทดสอบ 5 สายพันธุ์
        : ให้เชื้อสัมผัสกับน้ำยานาน 5 นาที
        : ปริมาณเชื่อต้องลดลง 5-log reduction
        (10^5 fall in viable cells / mL)
- - - - ยาไม่ปราศจากเชื้อ
        (non-sterile products) และวัตถุดิบ
        
        : microbial limit test
        
        หลัก
        
        นับจำนวนเชื้อ(viable aerobic
        microorganism) เทียบกับข้อกำหนด
        
        วิธี 2 วิธี
        
        plate method
        
        multiple tube method
        
        : microbial enumeration test
        
        หลัก
        
        เป็ นการนับจำนวนเชื้อที่เติบโตในสภาวะที่มีอากาศ (aerobic condition)
        
        วิธี 3 แบบ
        วิธีขึ้นกับประเภทของตัวอย่าง
        
        membrane filtration
        
        TAMC
        
        TYMC
        
        plate count method
        
        surface spread method
        : กระจายตัวอย่าง 0.1 mL
        ลงบนอาหาร
        
        pour plate method;
        : ตัวอย่าง1ml+อาหาร15-20ml
        
        เมื่อทดสอบวิธีอื่นไม่ได้
        
        MPN method
        : the most-probable-number
        
        ทดสอบกับตัวอย่างที่ความเข้มข้นต่างกัน 10 เท่า จำนวน 3 Conc
        : ตัวอย่าง 1g(1ml) + อาหาร 9 ml ในหลอดทดลอง
        เพาะเลี้ยงเชื้อที่ 30-35 องษา เป็นเวลาไม่เกิน 3 วัน
        
        : test for specified microorganisms
        
        หลัก
        
        เป็ นการตรวจสอบเฉพาะเชื้อที่กำหนด เช่น เชื้อที่ห้ามมีในตำรับนั้นเด็ดขาด
        เป็ นการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่จ าเพาะต่อเชื้อนางที่ทราบน้ำหนัก
      - ยาปราศจากเชื้อ
        (sterile products)
        
        : pyrogen test
        ( bacterial endotoxin test)
        
        การทดสอบ
        
        pyrogen test
        : ทดสอบการก่อไข้ในกระต่าย (in vivo)
        
        Limulus Amoebocyte
        Lysate (LAL) ของแมงดาทะเลสายพันธุ์จำเพาะ
        
        bacterial endotoxin test
        : ทดสอบการมี endotoxin
        ในหลอดทดลอง (in vitro)
        
        เป็ นการทดสอบปฏิกิริยาเชิงเอนไซม์ที่มีใน LAL
        
        อาศัยการสังเกตการเกิดวุ้นแข็งหรือการเปลี่ยนสีของสารตัวอย่างกLAL
        
        : sterility test
        
        วิธี
        
        Direct inoculation
        : ใช้กับ single dose SVP : ไม่มีสารกันเสีย
        เป็ นการผสมตัวอย่างลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเลย
        
        membrane filtration
        : ใช้กับ multiple dose SVP และ LVP
        เป็นการกรองตัวอย่างผ่านเมมเบรน แล้วนำเมมเบรนไปเพาะเลี้ยง
        
        หลัก
        
        ตัวอย่าง + อาหารเลี้ยงเชื้อ →
        เพาะเลี้ย(incubation) → บันทึกผล
        
        จำนวน/ปริมาตรตัวอย่างขึ้นกับประเภท FP
        
        การทดลองทดสอบกับเชื้อ 6 ชนิด
        
        ตัวอย่าง
        
        เชื้อ
        
        การตีความ