Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
Подготовка материала к гистологическому исследованию (6. Окрашивание…
Подготовка материала к гистологическому исследованию
1. Взятие материала
Пути получения
биопсия
операционный материал
аутопсия
экспериментальный материал
Соблюдать!
Забор самого свежего материала (сразу после смерти / при жизни)
Забор острым инструментом
Размеры 10х10х5
Маркировку
2. Фиксация материала
Цель:
сохранить прижизненную морфологию клеток
Как?
Фиксатор денатурирует белок, стабилизирует липиды
Виды
Заморозка (струя СО2 или жидкий азот)
Простые фиксаторы = 1 компонент (спирт, ацетон, глутаровый альдегид)
Основой фиксатор
: 10%-ый забуференный нейтральный формалин
Сложные фиксаторы
р-р Карнуа, р-р Ценкера, р-р Буэна
Соблюдать!
Время: не менее 1 суток
Объем фиксирующей жидкости больше объёма образца в 20 раз
3. Уплотнение материала
Цель:
придать ткани прочность
Зачем?
Для получения тонких срезов в дальнейшем
Способы
Заморозка
Пропитка уплотняющими средами
Этапы
Промывка в проточной воде
Вымывается фиксатор. 2-3 часа.
Дегидратация
Удаляется вода в спиртах восходящей концентрации. От нескольких часов до суток в каждом.
Просветление
Выдержка в ксилоле для прозрачности срезов. Несколько часов.
Пропитка
Уплотнение тканей в парафине. Несколько часов до суток и более.
4. Заливка материала
Цель:
закрепить кусочек ткани для лучшей нарезки + уплотнение
Этапы
Подборка формы
Бумажные коробочки-кораблики
Металлические формы
Пластмассовые формы
Заливка расплавленного парафина
Расположение и ориентация на дне формы кусочка
Охлаждение формы на холодной воде / в холодильнике
Прикрепление остывших блоков к деревянным брускам
5. Приготовление срезов
Виды срезов
3-8 мкм: из материала, залитого в парафин
10-25 мкм: из замороженного материала
0,1 мкм: из материала, подготовленного для электронной микроскопии
Виды микротомов
Криостатный
Замораживающий
Санный
Ротационный
Заключительный этап: перенос среза на заранее обезжиренное, смазанное смесью белка и глицерина предметное стекло
6. Окрашивание срезов
Основано на
тинкториальных свойствах
ткани
Методы окрашивания
Общие гистологические
Оценка общей морфологической структуры
Гистохимические
Анализ химического сотава
Энзимогистохимические
Определение ферментативной активности
Иммуногистохимические
Локализация специфических антигенов
Перед нанесением красителей:
Депарафинирование в ксилоле
Гидратация в спиртах нисходящей концентрации до воды
Типы общегистологических красителей
Основные
Связываются с НК, дают базофилию
Кислые
Связываются с щелочными соединениями, дают оксифилию
Нейтральные
Основные + кислые красители = нейтрофилия
7. Заключение среза
Перед заключением: проводка по спиртам восходящей концентрации до ксилола
Это помещение среза под покровное стекло с использованием заключающих сред
Виды заключающих сред
естественные
канадский бальзам, пихтовый бальзам
синтетические
полистерол