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Determinar a sequência de nucleotídeos →As, Ts, Cs, e Gs em um pedaço de…
Determinar a sequência de nucleotídeos →As, Ts, Cs, e Gs em um pedaço de DNA.
OUTROS MÉTODOS
SEQUENCIAMENTO DE SEGUNDA GERAÇÃO:
Fim das tecnologias baseadas em eletroforese;
Alta capacidade de geração de dados (genomas em única
corrida).
SEQUENCIAMENTO DE TERCEIRA GERAÇÃO:
Sequenciamento de uma única molécula de DNA (Sem amplificação);
Alta capacidade de gerar dados (genoma humano em única corrida).
Era da nanotecnologia;
Método de Ion Torrent
Baseia-se em base em nucleotídeos fluorescente-etiquetados
. Explorando o fato de que um íon de hidrogênio é liberado sempre que um nucleotídeo se atribui a uma fita de DNA, foram projetados sensores em microchip, para detectar esta assinatura química.
Método de Oxford Nanopore
Incorporaram um poro de proteína em uma membrana de polímero sintético dentro do microchip. A cadeia de DNA a ser sequenciado passa através do poro e, quando cada nucleotídeo atravessa, é registrado como um sinal elétrico diferente detectado pela máquina Oxford.
APLICAÇÕES DO SEQUENCIAMENTO DO DNA
A nível forense há o favorecimento no processo de identificação, cada vez mais exata;
O sequenciamento de DNA permitir determinar, de um modo mais preciso, riscos como os da exposição a vários tipos de radiações, reagentes mutagênicos e toxinas em geral.
Identificação de vítimas de catástrofes, acidentes;
Desenvolvimento de cultivares superiores de plantas;
Criação de novas fontes de energia, através da produção de bioagentes extraídos de microorganismos induzidos por mutações;
Paternidade.
SEQUENCIAMENTO DE DNA
SEQUENCIAMENTO PELO MÉTODO SANGER
Princípio:
→ Interromper a replicação de uma fita de DNA em diferentes regiões, gerando várias cópias desse DNA com tamanhos diferentes;
→ Juntar (sobrepor) todas essas cópias e construir (montar) a sequencia completa do DNA e DNA.
IGREDIENTES:
Amostra ( cDNA; DNA)
dNTPs (dATP; dTTP; dCTP; dGTP)
Tampão da enzima
Enzima DNA Polimerase
Iniciador (S ou AS)
ddNTPs ( ddATP; ddTTP; ddCTP; ddGTP)
→ Dideoxi (terminadores de cadeia)
para os quatro nucleotídeos
•A DNA polimerase adiciona nucleotídeos à cadeia até que seja incorporado um dideoxinucleotídeo ao invés de um normal;
• Os nucleotídeos não podem mais ser adicionados e a fita termina com um ddNTP;
• Ao final → tem-se várias fitas do mesmo DNA com número de resíduos diferentes
PONTOS NEGATIVOS DO MÉTODO SANGER:
• Baixa qualidade nos primeiros pares de base (até 40 pb)
• Dependente de enzima, preparo de amostras, kit e PCR, primers, purificação, etc.
• Sequencia entre 300pb e 800 pb
O processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla) do DNA a ser sequenciado, obtida por desnaturação da molécula nativa; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice.