Please enable JavaScript.
Coggle requires JavaScript to display documents.
DNA-seq (NGS (Pyroséquençage (500 kb): fait intervenir 4 enzymes: adnpol ,…
DNA-seq
NGS
Pyroséquençage (500 kb): fait intervenir 4 enzymes: adnpol , luciférase , atp sulfurase , apyrase : on prépare 1 SEUL mélange , chaque nuclotide incorporé une lumiere est générée et en fonction de son intensité on détermine le nucleotide . 3 pi-pi + APS ==> 3 ATP sulfurylase . 3 ATP sulfurylase + D luciférase ==> oxylucéferine + production de lumiere . si signal lumineux produit on sait que c'est celui qu'on vient de mettre qui a été incorporé . BASE CALLING : PYROGRAMME
limites
fragment de 450 - 500 pb seulement a cause de l'apyrase qui finit par tout enlever (apyrase utilisé pour nettoyer milieu , elle dégrade le surplus qui n' a pas été incorporé par adn pol)
séquençage par synthèse : 150-250 kb cette methode utilise dnp fluo , chacun avc une couleur de fluo spécéfique à chaque fois qu'un nuc est incorporé un signal fluo qui lui ai propre est produit. BASE CALLING : SUITE D'image
-
illumina : entre 100-200 pb) fragmentation , librairie , séquençage , avantage BARCODING : oligo a dans P7 barecodé et oligo b dans P5 universel ) . librairy ; amplification par pcr bridge , brin 5' gardé par liaison covalente ) . 1 molecule ==W 1 cluster ==> 1 read. chaque nuc au moment de son incorporation émis un signal lumineux d'une longueur d'onde spécéfique . 1 couleur par nucleo , donc ici dntp FLUO
séquençage protons ,200 pb ) quand un dntp est incorporé un proton est libéré ce qui émis un signal électrique. , ici chaque fragment est dans une bille par puit , on ajoute les nucleo 1 par 1 , si incorporation du nuc ajoouté ==> changment voltage ==> base calling . voltage proportionnel au nb de nuc incorporé. BASE CALLING : SPECTRE PH
nanopore sequencing:( 2000 pb)+ rapide + deux brins en même temps + pas besoin d'enzymes. les nanopores sont des proteines transmembranaires des petites canaux "pores", lorsqu'un nanopore est immergé dans un liquide conducteur , les ions qui le traversent cela change le voltage , ici les motifs sont 4 par 4 . BASE CALLING SPECTRE DE VOLTAGE
-
-
Methodes
Séquençage avc didésoxyribonucléotides flurescents ("dye terminator sequencing") : ( 1000 kb) utilisation de ddntp fluoresent (d'ou l'appelation) , dans cette methode on ajoute les nuléotides 1 par 1 par la suite ==> electrophorese et detection signal lumineux , chaque base a un signal propre. BASE CALLING : CHROMATOGRAMME
-
Sanger 1000 kb : utilise ddntp (absence groupement OH en 3' donc pas possible d'être intégré par adn pol) en petite concentration qui arrête la polymélirasition de maniere aléatoire , 4 tubes diff avc chacun un type de ddntp , cette methode n'est pas haut début + utilisation de radioactivité ==> séparation sur gel pour identifier la sequence
-
-
-