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Techniques pour la recherche de mutations (LES DIFFÉRENTS TYPES DE…
Techniques pour la recherche de mutations
LES DIFFÉRENTS TYPES DE MUTATIONS ET DE TECHNIQUES
UTILITÉ DE LA RECHERCHE DE MUTATIONS
Définir un facteur de risque
Proposer un traitement approprié
Poser un diagnostic
La recherche de mutations en routine
Mettre en place une prévention
Les mutations germinales
Particularités
Mise en évidence
LES MUTATIONS SOMATIQUES
Particularités
Mise en évidence
Quantités d'ADN dans les prélèvements
Limites
Amplification spécifique de la région d'intérêt soupçonnée de contenir la mutation
Mutations recherchées par les techniques
Situations et contextes
Situations
Techniques de choix
Intérêt
PROPRIETES DE L'ADN UTILISEES DANS LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
DÉNATURATION/RENATURATION
Dénaturation de l'ADN
Renaturation de l'ADN
Température de fusion Tm = point de fusion = TOC d'hybridation
UTILISATION DE CES PROPRIÉTÉS POUR LA SYNTHÈSE D'AMORCES ET DE SONDES
Propriétés communes
Hybridations spécifiques et non-spécifiques
Différenciation entre une amorce et une sonde par leur utilisation
la PCR
Milieu réactionnel
Type de réaction
Composition du milieu réactionnel
Étapes
Nb d’étapes
Thermocycleur
DÉTAIL DES DIFFÉRENTES ÉTAPES
Dénaturation
Hybridation des amorces
Amplification
Paramètres permettant le choix de la séquence des amorces en pratique
Leur contenu en GC
Leur TM
Produits de PCR
Ajustement et taille des Amplicons
Nombre et durée des cycles
Taille des amplicons doubles brins obtenus
Visualisation
Électrophorèse en gel d'agarose
Révélation au bromure d'ethidium
Les techniques de sequencage : la méthode de
SANGER
CONTEXTE
Mutations recherchées
Particularités
ÉLEMENTS NÉCESSAIRES DANS LE MILIEU RÉACTIONNEL
Eléments nécessaires à la réalisation d'une PCR
Les 4 ddNTP
Obtention d'un mélange de fragments
Incorporation d'un nucléotide par la Taq polymérase
Blocage de l’Élongation
ANALYSE DES FRAGMENTS OBTENUS
Electrophorèse capillaire
Interprétation de l'électrophorégramme
Les techniques de sequencage :
LE PYROSÉQUENCAGE
CONTEXTE
Etape de polymérisation
Éléments nécessaires dans le milieu réactionnel
Action de la polymérase
Action des autres Enzymes
De la sulfurylase
De la luciferase
De l'apyrase
LECTURE DU PYROGRAMME
Individu homozygote pour la séquence
non mutée
Individu hétérozygote
Individu homozygote pour la séquence
mutée
Recherche une mutation connue :
l'Analyse de fragments
Etapes
PCR en présence d'une amorce fluorescente
Lecture des résultats
CONTEXTE
Application
Exemples de resultats
Limites
Recherche d'une délétion du gène de l'EGFR
Recherche une mutation connue :
La discrimination allélique
Contexte
Sondes utilisées
Séquences reconnues
Éléments portés
ETAPES
Lorsque les sondes sont intactes
Dégradation des sondes
Emission de la fluorescence
LECTURE DE LA FLUORESCENCE
Exemple
La courbe de fluorescence
RECHERCHE DE LA PRÉSENCE D'UNE MUTATION PAR LA TECHNIQUE DE HRM
Méthode
Dénaturation de l'ADN et Tm
Suivie de la dénaturation
ÉTAPES
Augmentation progressive de la température
Renaturation
Contexte
LECTURE DES RÉSULTATS
Courbes de fusion
Modifications de la Tm
Interprétation
Limites