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Techniques d'étude du génome (Les techniques productives : les…
Techniques d'étude du génome
Les outils de
biologie moléculaire
: PROPRIÉTÉS DE L'
ADN
UTILISÉES POUR L'
ÉTUDE DU GÉNOME
PROPRIÉTÉS PHYSICOCHIMIQUES PROPRES
Structure de l'ADN
Charge
Solubilité
Absorption maximale dans l'UV
Etudes
descriptives
: les
enzymes
de
RESTRICTION
Propriétés
Sites de restriction
Reconnus spécifiquement par les enzymes de restriction
Courtes séquences : 4-8 pb
Très souvent palindromiques ; même enchaînement de paires de base de 5' vers 3' des brins sens et antisens
Spécificité de leur reconnaissance par les enzymes de restriction très importante _toute modification d'une base entraîne donc la perte de reconnaissance par ces enzymes
Nature
Endonucléases .
Origine bactérienne.
Permettent à une bactérie de résister à un virus.
Coupent des molécules d'ADN double-brin.
Très largement utilisées dans les laboratoires de biologie.
Nombreuses applications.
Extrémités de l'ADN générée
Types d'extrémités
Différentes enzymes de restriction selon les extrémités des fragments qu'elles génèrent : o extrémités collantes = cohésives : monobrins sur quelques bases O o extrémités franches : doubles-brins O
Sites de restriction
Extrémités formées
Profil et carte de restriction
Profil de restriction
Correspond à la localisation des sites de restriction d'une enzyme de restriction sur une molécule d'ADN.
Pour une même enzyme de restriction et une même séquence, le profil de restriction obtenu sera le même.
Carte de restriction
C'est la localisation des sites de restriction : o de plusieurs enzymes de restriction O o sur une même molécule d'ADN
Réalisée après avoir obtenu une combinaison de profils de restriction de plusieurs enzymes.
carte de restriction du plasmide pUC18/19.
o l'action d'enzymes de restriction sur un plasmide permet de le caractériser
Réassociation possible des fragments obtenus par l'action des enzymes de i restriction pour reformer la séquence d'origine.
TECHNIQUE D'
EXTRACTION
DES MOLÉCULES D'
ADN
AU
PHÉNOL-CHLOROFORME
Etapes
Lyse des cellules : libération du contenu des cellules, en particulier de l'ADN.
Extraction de l'ADN par un ajout d'un mélange de phénol-chloroforme qui permet de dissoudre les protéines et les lipides.
Précipitation de l'ADN en ajoutant une solution d'éthanol ou d'isopropanol pur très froid o formation d'une « méduse » masse blanchâtre d'ADN solide qu'il est possible de récupérer avec la pointe d'une pipette
Purification dans l'éthanol à 70% puis redissolution.
Dosage et mesure de la pureté.
Vérification de la qualité de l'ADN.
Etudes
descriptives
: le RFLP
Définition
Application des enzymes de restriction.
Technique d'étude de polymorphismes de longueur des fragments de restriction = Restriction Fragment Length
Mutations recherchées
Le
polymorphisme
ou la
mutation
doit
modifier
Etapes
Etudes descriptives :
L'HYBRIDATION MOLÉCULAIRE
Définition
Processus caractéristique des acides nucléiques au cours duquel 2 simples brins (SB) complémentaires (ADN ou ARN) d'origines différentes s'apparient pour former une double hélice (2 SB = 1 DB).
S'appuie sur les propriétés de dénaturation/renaturation des molécules d'ADN.
En pratique, l'ADN est étiré et dénaturé par chauffage pour séparer les 2 brins, puis renaturé en présence d'une sonde .
Les 2 brins d'ADN s' hybrident alors à nouveau = renaturation.
ohybridation possible entre 2 brins d'ADN dont quelques bases ne sont pas complémentaires o hélice formée moins stable
Formation d'hybrides ADN/ARN possible.
Solidité de l'hybridation modulée selon les conditions de stringence : oTo c o pH o force ionique = concentration en sels de cations monovalents tels que le Na+
oTo c ; pH ; force ionique = concentration en sels de cations monovalents tels que le Na+
Conditions
Peu stringentes : o TO C basse o concentration saline forte hybridation plus facile même si les séquences ne sont pas parfaitement complémentaires mais plus fragile, instable
Stringentes : o TO C élevée o concentration saline basse O hybridation spécifique O mais plus difficile à déstabiliser
Les sondes
Molécule d'ADN SB complémentaire de la région d'ADN d'intérêt .
Marquée par un radioisotope ou un fluorophore et ainsi détectable par : radiographie obtention d'un auto-radiogramme o fluorescence
Principes et utilisations du Southern Blot
Principe
Technique créée par Edward M Southern en 1975.
Basé directement sur l'hybridation moléculaire.
Utilisation
Pour mettre en évidence une séquence d'intérêt spécifique parmi un mélange de fragments d'ADN
Techniques dérivées
Nothern Blot pour identifier un ARN.
• Western Blot pour identifier une protéine à l'aide d'un anticorps.
ÉTAPES DU SOUTHERN BLOT
Fragmentation de l'ADN
Dénaturation
Blotting = transfert
Hybridation spécifique de la sonde
Révélation de la sonde
Les techniques productives : les vecteurs
Caractéristiques
Molécules d'ADN DB capables de se répliquer.
Permettent le clonage moléculaire
Vecteur de clonage
Utilisé pour amplifier une séquence d'ADN d'intérêt .
Obtention d'un très grand nombre de la séquence d'intérêt qu'il contient.
Intérêt particulier dans la constitution des banques d'ADN.
Vecteur d'expression
Utilisé pour exprimer une protéine dans une cellule hôte à partir de la séquence d'intérêt .
Expression du gène d'intérêt et production de la protéine en grande quantité par le système cellulaire.
Protéine ensuite récupérée en vue de l'étudier.
Contient un promoteur situé en amont du site d'insertion .
Le bacteriophage de type
Taille inserts possible (kb)
10-15
Cellule hôte privilégiée
Bactérie
Caracteristiques
Le Plasmide
Taille inserts possible (kb)
0,5—6 0.
Cellule hôte privilégiée
Bactérie
Caracteristiques
Les cosmides
Taille inserts possible (kb)
30-45
Cellule hôte privilégiée
Bactérie
Caracteristiques
Les chromosomes artificiels
Taille inserts possible (kb)
BAC : < 300 00
YAC : 1000 - 2000
Caracteristiques
Les techniques productives : le clonage moléculaire
Applications
PREMIÈRES ÉTAPES
Préparation du vecteur et de l'insert
Clonage
Transformation bactérienne
MOLÉCULAIRE DERNIÈRES ÉTAPES
Mise en culture et sélection des clones
Amplification
Les techniques productives : LES BANQUES À ADN
Une banque est une collection
Libre accès à la communauté scientifique
Types
Banques d'ADN génomique
Banques d'ADN complémentaire
Les techniques productives : La Reverse-Transcription
L'ARN
Etapes
Transcription inverse
PCR
Les techniques productives :Puces a ADN
PRÉPARATION DES ADN COMPLÉMENTAIRES
AUTRES ÉTAPES
Hybridation
Lecture de la fluorescence
Analyse de la fluorescence des spots
Analyse statistique de la fluorescence
COMPARAISON DU NIVEAU D'EXPRESSION DE GÈNES
Applications des puces à ADN
Génomique comparative
Inconvénients