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Contrôle de la qualité microbiologique (Méthode d'analyse (Critères…
Contrôle de la qualité microbiologique
Qualité microbiologique
Besoins
Diponibilité
Fiabilité technologique
Aptitude à l'
emploi
Sûreté hygiénique
Minérale & chimique
Organique & biologique
Organismes
Dictent les méthodes
COFRAC, AFNOR, Pharmacopée
Contrôlent le produit fini & sanctionnent
DGCCRF, DDI, SCL (département)
Conseillent
ANSES, ANSM
Qualité :
propriétés & caractéristiques d'un produit
à satisfaire des besoins
Sources de contamination
Eau
100 cellules/mL
Surfaces
production alimentaire => Biofilm :warning: :warning: :warning:
Air
1 cellule/produit injectable
Personnel
Beaucoup de germe faire :warning: à na
pas
faire
de transfert
Analyse
mirobiologique de routine
Prélèvement puis mise en culture
:warning: condition aseptique
Prélèvement et suspension mère
Cas des matières premières & produits finis
Suspension mère représentative & homogène
Prélèvement mis en suspension dans un diluant
Homogénéisation
Eventuellement neutralisation
Agent chimique
Filtration & lavage
Eventuellement revivification
Incubation
Mettre en suspension mère
Cas des surfaces
Méthodes directes
Boite de contact, lame de surface, film gélosé
Méthodes indirectes par frottis
Ecouvillonnage (coton-tige ou brosse stériel :warning:) puis suspension
Permet la réalisation de dilutions
Nombre
variable d'analyses selon
produit & risque
Consommé ou pas ? Par qui?
Cru ou cuit ? Composition?
Cas de l'
air
Piégé l'air dans une boite de pétri
En condition
aseptiques, représentatif
De ce que l'on veut analyser
Recherche de germes pathogènes
Systématique
Staphylocoques pathogènes
Salmonelles :arrow_right:
TOLERANCE 0
Variable
Listeria
Campylobacter
Valeurs limites variables selon les produits
Milieux sélectifs & différentiels
Cytométrie, tests enzymatiques, immunologiques & moléculaires
Vibrio (poisson)
Pseudomonas (cosmétique, eau de baignade)
Recherche de toxines d'origine microbiennes
Test immunologique
Analyse de l'
hygiène
générale (aliment)
Etudes
Quantitative :
germes aérobies & mésophiles
Qualitative :
germes test
Coliforme totaux & fécaux
Entérocoques (streptocoques fécaux)
Eau impropre à la baignade
Valeurs limites variables selon les produits
Milieux complets
Cytométrie, coloration
Clostridium sulfito-réducteurs
Milieux sélectifs & différentiels
Cytométrie, test enzymatiques
Méthode d'
analyse
Critères communs aux méthodes de routine et méthodes rapides
Coût
Reproductibilité
: Manipulateur, géographique
Spécificité
: Absence de faux résultats
Sensibilité
: Répondre à la réglementation & permettre la détection en fonction de la législation
Méthodes rapides
Consistent
Limiter, voire supprimer les étapes de culture (cellules viables non cultivables)
Simplifier
Automatiser
Exemples d'outils & de tests de marquage
Fluorochromes spécifiques / affins des cibles cellulaire
ou témoin d'activité cellulaire pour le dénombrement total
Enzymes spécifiques d'activité ou de groupes bactériens
utilisation de substrats spécifiques :arrow_right: produits colorés, fluorescents, luminescents (ex: luciférase)
Test utilisant des anticorps
reconnaissance antigène-anticorps
Utilisation d'anticorps reconnaissant les antigènes spécifiques
Sérotypage
par agglutination
Test immuno-enzymatiques
: utilisation d'anticorps couplés à des enzymes (PA, peroxydase)
Test utilisant des bactériophages
infection spécifique d'une espèce cible
Utilisation de phage recombinant exprimant un gène rapporteur
Compteur Coulter & cytométrie de flux
Compteur Coulter
Compte & mesure la taille de particules circulant dans un électrolyte
Mesure un changement de tension proportionnel à la taille
Pas de distinction particule - cellule
Pas de distinction cellule vivante - morte
Cytométrie de flux - FACS (Fluorescent Assisted Cell Sorting)
Mesure des propriété optiques des cellules transportées dans un liquide vecteur jusqu'à une source d'excitation lumineuse comme un laser
FSC diffusion de la lumière aux petits angles (axiale)
SSC diffusion de la lumière à angle droit (latérale)
:arrow_right:
Taille, forme - granulométrie, fluorescences
Méthodes moléculaires
PCR
PCR nichée
Plusieurs couples d'amorces qui ciblent la même séquence pour augmenter la spécificité
Détection directe des amplicons
Utilisation d'une ou des deux amorces marquées (fluorochromes, haptène...)
Incorporation lors de la PCR de fluorochrome ou haptène en utilisant des dNTP marqués
Agent intercalant BET, SYBR green
PCR multiplex
Plusieurs couples d'amorces qui ont des cibles différentes
Pour inclure des contrôles positifs
Pour détecter plusieurs cibles (germes ou séquences)
Détection indirecte des amplicons
Ampicon obtenu par PCR hybridation avec une sonde marquée
Structure en épingle à cheveux avec un fluorochrome et un extincteur
2 sondes ciblant régions voisines avec 2 fluorochromes aux spectres superposables
PCR simple
1 couple d'amorces spécifiques du germe à détecter
La PCR permet la détection : absence / présence , pas la quantification
Etapes préalables : rendre accessible la matrice
Lyse cellulaire
Purification des acides nucléiques
PCR quantitative avec SYBR green ou des sondes fluorescentes
A chaque cycle de PCR il y a émission de fluorescence jusqu'à un niveau seuil de détection
Plus l'échantillon est concentré à l'origine, moins il faudra de cycles pour atteindre le niveau seuil de fluorescence
Permet de donner le nombre de copies de la cibles = quantification