Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

스테인드 글라스를 이용한 다중 체널 형광 검출 시스템 <출원서> (배경기술 (

스테인드 글라스를 이용한 다중 체널 형광 검출 시스템 <출원서>

본 발명에 대한 내용

해결 수단 및 방법

1. 정의

샘플
샘플은 광학 여기와 판독에 의해 검출 될 수 있는 물질을 말한다.

샘플 챔버
본 발명에 있어서 액체로 되어있는 샘플을 수납하는 것이 가능한 임의의 용기를 "챔버"라 한다.

광원
형광으로 되어 있는 분석 항목을 분석을 하기 위해서 전자기장을여기 하는 것이 가능한 디바이스를 광원이라 부른다. 통상 검출에서 사용 되는 광원은 LED, 광 벌브 , 할로겐 램프 및 레이저 를 포함한다. 본 발명에서는 LED를 광원으로 채택하여 사용한다.

검출기
전력을 검출 하는 것이 가능한 디바이스를 검출기라 부른다. 통상 검출기는 CCD, CMOS 검출기, 포토다이오드. 광증 배관 을 사용한다.

파장
전자기 파장을 말한다.

교수님 확인

2. pcr챔버
종래의 PCR기기들은 대부분 샘플을 튜브라는 챔버에 넣어 사용하는 것을 기본으로 두어 나온다. 이에 의해 플랫하며 형광 검출의 면적이 좁고 깊은 튜브를 검출하는데 어려움을 겪는다.
본 발명에 사용되는 챔버는 형광의 검출 면적이 좁은 튜브가 아닌 폴리프로필렌을 사용하여 광학 투명도를 갖는 넓게 펴진 챔버를 사용한다. 이는 광학적 많은 해결점을 줄 수 있다.
이는 혼합 샘플에 해당 되는 여기 광을 구별 하는 파장들로 나눠서 검출 가능 해진다. 넓게 펴진 챔버는 검출이 가능한 면적이 넓어 진다. 여기 광 별 챔버의 공간을 분할을 해도 여러 파장대 별 검출이 가능 해지기 때문에 이는 다중 형광 검출이 가능한 시스템이 된다.

교수님 확인

3. 모듈
위의 시스템 모듈은 일체형이지만 2개의 광학계로 나눈다. 제1광학계는 반응 혼합물로 여기 광을 전송하는 4개의 파장 대 광원을 가지며 각각의 여기 광을 필터링 하는 4개의 필터의 집합체이다. 이는 반응 혼합물로부터 형광체를 여기하기 위해 활성화 되며 해당 여기의 광원과 필터는 제1의 하우징에 고정되어 있다.
제1의 광학계는 일체형 하우징 모듈에 90도씩 같은 조사 각도로 고정되어 물리적으로 안정적이며 광원 길이의 균일성을 가져온다.
제2의 광학계는 챔버로부터 방출된 광을 4개의 분석적인 항목으로 검출하는 4개 파장대 필터를 모아둔 집합체이다. 이는 제 1의 광학계에서 45도 내각으로 이루어진 가운데 부분에 모여져 있다. 위의 4개의 검출 필터는 하나의 검출기로 통해서 크로스톡 검출시스템을 이룬다.

교수님 확인

발명의 효과

본 발명의 형광 여기와 방출 검출 장치는 고정 되어있는 간단한 일체형 모듈로 이루어져 있다. 종래 기술처럼 형광별 단일 세트로 이루어져 있지 않기 때문에 이에 필요한 부수적인 기계적 부품들이 필요 없다.

또한, 서술되어 있듯이 부수적인 소모품이 없기 때문에 종래의 기술에 비해 검출부분의 광학계의 면적과 부피가 많이 줄어 plamtop형 기기로 가능하다.

광원 길이의 균일성을 가지고 있기 때문에 서로 다른 광원에 일정한 검출결과를 얻을 수 있다.

교수님 확인

해결 하려는 과제
상술한 종래 기술의 문제점을 줄이기 위해서,본 발명은 PCR의 형광 검출 부분인 광 검출기를 간단하게 배치하고, 여기광을 통한 광혼합물의 여기와 방사광을 통한 형광 검출방식을 더욱 개선하여 종래 기술의 제한(복잡한 구성과 값비싼 부품)점을 해결할 수 있도록 한다.

교수님 확인

기술분야

요약

본 발명은 핵산 증폭 분석용 형광 검출 장치에 관한 것이다. 본 발명의 형광 검출 모듈은 광학적 여기 및 검출부가 포함된다. 챔버내에 혼합 샘플의 분석 항목을 검출 하기 위해 다중 파장 범위 의 광원과 필터를 사용한다. 여기부는 파장별 광원과 필터가 작은 유닛으로 이루어져 있다. 검출부에서는 챔버 통해 방출된 광을 다수의 방출 파장으로 검출 하기 위한 다수의 필터가 하나의 유닛으로 이루어져있다. 여기부와 검출부가 일체형인 모듈로 되어 복수의 분석 항목을 동시에 검출 가능한 다중 채널 시스템을 보여준다.

교수님 확인

기술분야

본 발명은 DNA 증폭 과정에서 측정을 수행하기위한 방법인 광학적 검출 시스템에 관계한다. 특히, 챔버내에 샘플에서 복수의 상이한 성분을 검출하기 위한 다중 체널 형광 검출 시스템에 관한 것이다.

교수님 확인

배경기술

분자진단의 형광 검출법
분자진단은 세포 내에서 일어나는 분자 수준의 변화를 수치나 영상으로 평가하는 진단법으로 유전자의 발현 및 질병 유전자를 연구함으로써 이를 통해 치료적 방향성을 제시 하는 진단검사의학 분야에서 요구되는 진단 기술이다
중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)기술은 소량의 유전자로 유전질환외에 감염성 질환 진단에도 이용되는 유전자 증폭기술로서 분자진단 분야의 기술 발전에 가장 핵심적인 기술이라 볼 수 있다.
PCR을 통해 증폭한 DNA를 검출하기 위한 방법으로 형광 검출법이 주로 이용된다.
여러 분석 화학물질(assay chemistry)이 실시간 PCR 검출 방법에 이용되고 있다
생화학적 분석을 위한 바람직한 검출 기술은 광학적 검색이고, 전형적으로 형광 또는 화학발광 측 정을 사용한다. PCR 시험용으로, 형광 화학이 채택된다.
광 검출 광학계는 미세유체칩이나 PCR 칩과 같은 미세 유체 소자 내에서 일어나는 바이오 반응에 의한 형광 신호 레벨 또는 그 변화량을 측정하기 위한 것이다. 예를 들어, 형광 검출 광학계는 형광 염료로 표지된 샘플에 여기광을 조사하고, 여기광에 의해 여기된 형광 염료로부터 방출되는 형광을 검출한다.
현재 이용되는 실시간 PCR의 단점은 제한된 다중화 가능성(multiplexing capability)이다. 현재의 실시간 PCR기술은 용해 상태의 자유로운 리포터 형광색소(reporter fluorochrome)를 이용한다. 이러한 설계는 복합 반응물(multiplex reaction) 내에서 각 분석을 위한 스펙트럼에서 상이한 형광색소의 이용을 필요로 한다. 가령, 4개의 표적 서열을 검출하도록 설계된 복합 반응물은 제어장치(control)를 보유하지 않으면서, 스펙트럼 구분(spectral differentiation)으로 4개의 상이한 자유 부동 형광색소를 구별할 수 있는 장치를 필요로 할 것이다.이들 장치는 실질적인 다중화 기능성을 제한할 뿐만 아니라 비용을 증가시키는데, 그 이유는 이런 장치가 전형적으로, 복수의 레이저(laser)와 필터(filter)를 필요로 하기 때문이다. 현재의 실시간 PCR 기술은 대략 1-6중(plex)의 다중화 가능성을 갖는다

정보문서

분자진단은 세포 내에서 일어나는 분자 수준의 변화를 수치나 영상으로 평가하는 진단법으로 유전자의 발현 및 질병 유전자를 연구함으로써 치료적 방향성을 제시하는 진단검사의학 분야에서 요구되는 진단 기술이다.
중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)은 검출을 원하는 소량의 특정 표적 유전물질을 증폭하는 기술로서 유전 및 감염성 질환에 사용되고 있으며 분자진단 분야에 가장 핵심적인 기술이라 볼 수 있다.

분자진단은 세포 내에서 일어나는 분자 수준의 변화를 수치나 영상으로 평가하는 진단법으로 유전자의 발현 및 질병 유전자를 연구함으로써 유전과 감염성 질환에 대해 예방과 치료적 방향성을 제시를 가능하게 한다.
중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)은 검출을 원하는 소량의 특정 표적 유전물질을 증폭하는 기술로서 분자진단 분야에 가장 핵심적인 기술이라 볼 수 있다.

생화학적 분석을 위한 바람직한 검출 기술은 광학적 검색이고, 전형적으로 형광 또는 화학발광 측 정을 사용한다. PCR 시험용으로, 형광 화학이 채택된다.

생화학적 분석을 위한 검출 기술로는 광학적 검색이 바람직하다. 비 침습적이고 유전자의 증폭과 양을 동시에 측정가능한 실시간 PCR하기 위한 방법으로 형광 화학 검출법이 이용된다.

RT-PCR은 특정 피장의 빛 에너지를 흡수하였다가 고유파장으로 빛을 발산하는 용해 상태의 리포터 형광 물질을 사용한다. 형광 물질의 바이오 반응 (FRET: fluorescence resonance energy transfer) 통한 형광신호 레벨 또는 변화량을 가지고 분석이 가능하게 된다. 형광 염료로 표지 된 샘플에 대한 고유 여기 광을 조사하고, 여기 파장 필터에 의해 여기 된 형광 염료로부터 방출되는 형광을 검출분석을 하기위한 방사 파장 필터 및 검출기와 같은 광 검출 광학계 가 필요하다.

현재 실시간 PCR은 다중 형광 검출 시스템으로 개발되고 있다. 복합 반응물 (multiplex reaction)내에 각각의 분석을 위해서는 스펙트럼에 해당되는 형광색소가 이용되며 이를 구별할 수 있어야 하는 개별 광학적 검출 계들이 필요하다. 이는 다중화 검출을 위한 복잡한 구성, 필요 광학계 연결을 위한 부속 기기의 부피의 차지와 같은 기능적 제한 그리고 값비싼 가격에 대한 비용적 제한의 단점들을 가져온다.

기존 기술 구성 및 작용
화학 반응의 실시간 광학적 모니터링을 요구하는 새로운 공정용 기구는 최근에 유용하게 되었다.이러한 기구중의 하나가 노스럽 (Northrup) 등에 의해 미국 특허 제 5,589,136 호에 개시된 MATCI 장치이다.이 장치는 PCR 열 순환 및 광학적 분석에 모듈 방식을 사용한다. 각각의 화학 반응은 그 자신의 실리콘슬리브에서 실행되고 각각의 실리콘 슬리브는 그와 연관된 여기 광원 및 형광 검출기를 갖는다. LED 및고체 상태 검출기를 사용하여, 실시간 광학적 데이터는 소형의 저전력 모듈으로부터 얻는다. 그런데, 이장치는 각각의 모듈에 대해 단지 하나의 광원 및 하나의 검출기를 포함함으로써, 다수 분석 항목을 동시에 검출할 수 없다
예를 들어, Biorad 회사의 실시간 PCR(polymerase chain reaction) 기기 CFX96는 , 반응용기(13)는 열블록(15)에 구비된 시료웰(14)에 위치하며, 반응용기(13)에서 핵산 증폭 반응이 진행된다. 핵산 증폭 반응을 진행 하면서 일정 시간 간격으로 반응용기(13)로부터 발생되는 형광을 측정한다. 형광 측정에서, 광원(11)으로부터 여기광(22)이 발생되고 필터(17) 및 렌즈(18)를 거친 다음, 반응용기(13)에 제공되며, 반응용기(13)의 반응혼합물로부터 나오는 방사광(23)은 빔 스플리터(21) 에 의해 광 다이오드(즉, 광 검출기(12))로 안내되고 필터(19)와 렌즈(20)를 거친 다음 광 다이오드(12)에서 검출된다
상기 CFX96의 광학 셔틀과 같이, 광원이 반응용기의 위쪽에 위치하는 경우에는, 여기광이 비교적 좁은 면적의 반응용기 윗부분을 통과하여야 하기 때문에, 광원의 정교한 포지셔닝이 요구된다. 또한, 종래 기술은 모든 반응 용기에 대하여 동일한 광 경로 길이의 여기광을 적용시키는데 어려움이 있을 것으로 판단된다. 한편, 상기 CFX96의 광학 셔틀과 같이, 광 검출기가 반응용기의 위쪽에 위치하는 경우에도 광 검출기의 정교한 포지셔닝이 요구되며, 모든 반응용기로부터 동일한 광 경로 길이의 방사광을 검출하는데 어려움이 있을 것으로 판단된다.[0012] CFX96 기기를 포함하는 대부분의 실시간-핵산 증폭 기기는 정교한 광원과 광 검출기의 정교한 포지셔닝이 요구
또 다른 실시간 핵산 증폭 기기로서 AB7500(모델명, Thermo Fisher Scientific)은 핵산 증폭 반응이 진행되는 플레이트 상부에 5가지의 필터가 원형 디스크 형상으로 위치하고 그 위에서 하나의 광원을 조사하여 발현된 형광을 위에서 광 검출기로 검출하는 장치이다. 그러나, AB7500 기기는 하나의 광원을 플레이트 상부에서 한번 조사하여 발현된 형광을 검출하는 데 있어, 광이 원형으로 퍼지는 현상 때문에 직사각형 형상의 플레이트의 가장 자리 부분에는 그늘이 져서 형광 검출이 고르지 못한 단점이 있다.
다른 분석 기구는 Idaho Technologies 사로부터 입수가능하고 "The LightCyclerTM : A MicrovolumeMultisample Fluorimeter with Rapid Temperature Control", Bio Techiques, Vol 22, p. 176~181,1997년 1월호에 위트워 (Wittwer) 에 의해 개시되어 있다. 이 기구는 24 개의 샘플을 유지하고 광학계위쪽에 각 샘플을 순차적으로 위치시키기 위해 스테퍼 모터를 구비한 원형 커라우절 (carousel) 을 포함한다.샘플은 커라우절에 의해 유지되는 캐필러리에 설치되고, 각 샘플은 에피 일루미네이션에 의해 캐필러리 팁을 통해 검색된다. 광원은 샘플을 향해 제 1 이색성 필터를 반사하는 청색 LED 이다. 광은 에피 일루미네이션 렌즈에 의해 캐필러리 팁으로 포커싱되고 캐필러리 팁으로부터 집광된다. 캐필러리 팁으로부터 방출된 광은 제 1 이색성 필터를 통과하고, 일 이상의 추가 이색성 필터에 의해 필터링되고, 검출용 포토다이오드에 포커싱된다.이 도구가 화학 반응을 하게 되는 샘플의 다수 분석 항목을 검출하게 하지만, 몇 가지 결점이 있다.첫째, 조명 빔 및 방출된 광 빔은 동일한 볼륨을 통해 비교적 짧은 광로 길이를 갖고 캐필러리 팁 아래에 동일한 경로를 공유한다. 이는 샘플로부터의 형광 방출이 약해지게 하고, 광학적 검출 감도를 낮게 한다.둘째, 도구는 하나의 여기 파장 범위의 조명 광을 제공한다. 그런데, 서로 다른 형광 염료는 서로 다른최적의 여기 파장 범위를 갖음으로써, 도구는 반응 유체의 다수 형광 염료 각각을 위해 최적의 여기 파장 범위의 여기 빔을 제공하지 못한다. 셋째, 이색성 필터의 사용은 도구의 광학적 감도를 상당히 감소시킬 수도있다. 각각의 이색성 필터는 방출된 광의 강도를 1/2 정도 감소시킴으로써, 방출된 광이 검출기에 도달할때 약해질 수도 있다. 이와 같은 이유로, 도구는 샘플의 분류된 분석 항목의 형광으로 검출하는데 낮은 감도를 나타낼 수도 있다.

펜토니 (Pentoney) 등에 의한 미국 특허 제 5,675,155 호 공보에는 복수의 샘플 볼륨을 순차적이고 반복적으로 스캐닝하기 위해 또한 각각의 샘플로부터 방사 방출을 검출하기 위해 다른 검출 시스템이 개시되어 있다.시스템은 각각 샘플 볼륨을 수용하는 복수의 코플라나 (coplanar) 병립 캐필러리를 포함한다. 또한, 전자기 방사원, 전자기파를 수신하고 반사하기 위해 결합된 미러, 미러를 움직이는 스캐너, 샘플로부터 수집된전자기파를 필터링하는 필터 휠, 및 필터링된 방사를 수신하기 위해 결합된 검출기를 포함한다. 각각의 캐필러리 행의 샘플 볼륨은 전기 영동 매개체상에 분리된 형광으로 분류된 샘플을 수용한다.동작시, 방사원 (바람직하게는 레이저) 은, 미러상으로 여기 빔을 향하게 한다. 반사된 여기 빔은 포커싱렌즈를 통과하여 캐필러리 어레이내에 제 1 캐필러리의 샘플 볼륨상으로 진행한다. 샘플로부터의 형광 방출 방사는 레이저 원의 파장에서 광을 차단하고 샘플 볼륨의 제 1 형광 염료에 의해 방출된 형광을 전달하기위해 선택된 필터 휠의 제 1 필터를 통해 진행한다. 제 1 필터를 통해 전달되는 형광은 검출기에 의해 검출된다. 모터는 형광 방출 빔으로 제 2 필터를 가져오기 위해 필터 휠을 회전시킨다. 제 2 필터는제 2 형광 염료로부터 방출된 형광을 전달하고, 형광은 검출기에 의해 측정된다. 샘플 볼륨의 제 2 및 제4 염료의 형광 방출을 측정하기 위해 동일한 과정이 필터 휠의 제 3 및 제 4 필터로 반복된다. 전체 4단계 동작은 어레이의 각각의 캐필러리 행으로 순차적이고 반복적으로 실행된다.이 시스템은 샘플 볼륨의 다수 형광 염료의 검출을 하게 하지만, 미러를 이동하고 필터 휠을 회전하는데 몇 개의 결점이 있다. 이 이동 부분들은 광학 시스템의 높은 비용, 높은 유지 요구 조건, 낮은 신뢰도, 높은전력 소비, 및 광학적 측정으로 잠재적인 진동 방해를 일으킨다.

정보문서

기존 기술의 문제점

교수님 확인

shepid
챔버의 사이드를 통해서 형광을 검출 하는 시스템으로 이루져 있다. 이는 서로 다른 면로 통해 검출 되기 때문에 제1 제2의 광학 모듈이 나뉘어 져 있다.광학계에서는 다수의 형광을 방출 하기위해 여러개의 광원 및 필터로 이루져 있고 좁은 면적으로 포커싱하여 방사를 하기 위해서 여러개의 렌즈, 반사기 , 미러 그리고 시준하기 위한 광학적 윈도우가 필요 하다. 제2의 광학계에서 역시 방출된 형광을 검출 하기 위해서 각각의 파장대별 검출기및 필터가 필요하며 제1 광학계처럼 여러가의 부가적 렌즈, 반사 및 미러가 필요하다.

RTPCR은 특정 피장의 빛 에너지를 흡수하였다가 고유파장으로 빛을 발산하는 형광 물질을 사용 한다. 형광 물질은 intercalator type 그리고 형광물질이 결합된 primer 의 형태의 형광 dye를 사용하는 probe type 로 나눠진다.후자의 probe type을 사용할시 형광물질과 상쇄물질에 관계에 의한 FRET(Fluorescent Resonance Energy Transfer)현상이 일어난다. FRET란 특별한 파장의 빛에 의해 고에너지물질인 형광물질에서 에너지가 exitation되어 있지만 형광물질과 상쇄물질이 같이 있어서 빛을 발현을 안하다가 상쇄물질이 분리되면서 고에너지물질인 형광물질에 있던 에너지가 저에너지 물질인 상쇄물질로 넘어가면서 고유의 파장의 빛을 방출하는 현상을 말한다. 즉 probe type 경우를 고려해 고유 exicitation 과 emission 파장을 다루는 camera optic 시스템 이 갖춰줘야한다.