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La complémentarité des bases et son utilisation en génie génétique (II) La…
La complémentarité des bases et son utilisation en génie génétique
Définitions
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La complémentarité des bases :
Les bases azotées sont au nombre de quatre : adénine (notée A), thymine (T), guanine (G), cytosine (C). La complémentarité de ces bases, deux à deux, permet l'association des deux brins d'ADN : l'adénine est toujours appariée à une thymine et la guanine à une cytosine.
génie génétique
: Technique consistant à enlever, modifier ou ajouter des gènes à une molécule d'ADN [d'un organisme] de sorte à changer l'information qu'elle contient.
Problématique
:question: En quoi la complémentarité des bases et sa connaissance permettent de développer des techniques de génies génétique ?
I) L'ADN est constitué de 2 brins complémentaires
1) L'ADN est un double brin
chauffage (dénaturation) & mesure de l'absorbance
2) Complémentarité des bases
3) Watson, Crick et Franklin montrent que les brins sont appariés spécifiquement
II) La complémentarité permet une réplication fidèle de l'IG
1) Meselson et Stahl montrent que la réplication est semi-conservative
Présenter les trois hypothèses du mécanisme de réplication (semi-conservatif, conservatif, dispersif). Présenter l'expérience de Meselson et Stahl et ses conclusions. Montrer que la
semi-conservativitéest en cohérence avec la complémentaritévue plus tôt.
2) L'élongation d'un brin néosynthétisé complémentaire au brin matrice
Mécanisme de la réplication : brin direct, synthèse de l'amorce d'ARN (par complémentarité), élongation par complémentarité, mécanisme d'action des ADN-polymérases I et III.
Nécessaire séparation des deux brins (perte de la
Schéma : fourche de réplication
3) Des erreurs de réplications sont dues àun mauvais appariement
Expliquer la tautomérisation, montrer en quoi elle peut provoquer un mauvais appariement, montrer qu'un mésappariement peut déboucher sur une mutation (substitution).
Montrer qu'une modification chimique d'une base, comme une désamination, peut modifier la complémentarite
4) La réparation des mésappariement fait intervenir la complémentaritédes bases
Présenter les phénomènes de réparation de l'ADN, montrer qu'ils impliquent des événements de réplication. Présenter l'activitéexonucléasique 3'→5'
III) La complémentarité des bases est exploitée en génie génétique
1) Le Southern blot permet une détection d'ADN par appariement spécifique
Expliquer la problématique du Southern blot, et montrer l'importance de l'appariement spécifique
2) Le séquençage exploite la complémentaritédes bases pour déterminer la séquence d'un ADN
Expliquer le principe du séquençage, montrer que le séquençage repose sur une réplication, donc sur la complémentaritédes base
3) Nothern Blot
La technique du Northern blot met en évidence une différence d’expression.
Le Northern blot consiste à récupérer les ARN d’une ou plusieurs cellules et de les faire migrer sur un gel d’électrophorèse.
Après migration, les ARN sont transférés sur membrane de nitrocellulose afin d’obtenir une copie de la migration d’électrophorèse.
Afin de rechercher certains ARN, tous les ARN sont incubés avec une sonde radioactive complémentaire de l’ARN recherché. Si l’ARN recherché est présent, la sonde se fixe, sinon, elle ne se fixe pas.
Après nettoyage, seules les sondes fixées restent sur la membrane de nitrocellulose.
Si la sonde est fixée la cellule a exprimé le gène sinon le gène n’a pas été exprimé.
Le Northern blot permet de voir si un gène précis est exprimé dans une ou plusieurs cellules
4) Puce à ADN
Les puces à ADN sont des dispositifs qui fixent au fond des puits des fragments d’ADN monobrins correspondant à tous les gènes de la cellule étudiée. Tous les ARN de la cellule sont alors récupérés et associés à un marqueur fluorescent.
Ils sont amplifiés et mis au contact des puits. S’ils sont complémentaires, les ARN se fixent sinon ils partent au moment du lavage.
Ainsi après le lavage, si un puits marque une fluorescence cela signifie qu’un ARN s’est fixé et que la cellule exprime ce gène.
Les puces à ADN permettent de déterminer le transcriptome complet d’une cellule
D’une cellule à une autre et au cours du temps, on peut montrer qu’il y a une variation d’expression du génome :
Il existe donc des mécanismes de régulation de l’expression et de la transcription.