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PCR E CLONAGGIO DEL DNA (PCR (End- point PCR (alla fine dei cicli si…

- - - - annealing 55° i primer si appaiano ai filamenti di DNA stampo
      - estensione 75° estensione del filamento da parte della Taq (Thermus aquaticus) polimerasi o la Pfu che è più precisa
      - denaturazione 95° il DNA si denatura, i due filamenti si separano
    - - plot di amplificazione
        
        l'operatore sceglie una linea soglia (threshold) in modo da intersecare tutte le curve in fase esponenziale
        
        il ciclo in cui la fluorescenza supera la linea di soglia si chiama Ct, ciclo threshold
      - assoluta
        
        uso di DNA a concentrazione nota, uso di una standard curve
      - relativa
        
        si quantifica paragonando i Ct, serve un controllo endogeno, gli altri vengono paragonati ad esso
  - - - SYBR-Green
        
        molecola fluorescente poco costosa che si lega alle doppie eliche di DNA in modo non specifico. La quantità di molecole che si lega al DNA ( e la fluorescenza emessa) è proporzionale alla quantità di DNA a doppia elica
      - Taq-Man
        
        un oligonucleotide che presenta un Reporter al 5' (emette fluorescenza) e un Quencher al 3' (spegne la fluorescenza)
        
        esso si lega ad una regione specifica del DNA, quando la Taq polimerasi arriva a sintetizzare quella zona la sonda viene "rotta" in tanti piccoli frammenti allontanando così il Q dal R che emetterà quindi fluorescenza
      - molecular beacons
        
        oligonucleotidi con un Q e un R ma costruiti in modo da formare una struttura a forcina, quando si legano alla sequenza target il Q e l'R si allontanano e l'R emette fluorescenza. Non si distruggono e possono essere riutilizzati ad ogni ciclo
      - sonde FRET
        
        due sequenze con un fluorocromo ciascuna, un accettore e un donatore. Quando si legano alla sequenza target questi si avvicinano ed emettono fluorescenza rilevabile
- - - - caratteristiche fondamentali:
        
        origine di replicazione ori
        
        siti di taglio unici per più enzimi di restrizione (al di fuori delle regioni essenziali)
        
        marcatori di selezione (resistenze agli antibiotici, auxotrofie, permettono di individuare i batteri che hanno acquisito il plasmide)
      - caratteristiche utili ma non essenziali:
        
        conoscere la sequenza
        
        primer universali per PCR e sequenziamento
        
        elementi di controllo per la trascrizione (vettori di trascrizione) e traduzione (vettori di espressione)
      - evoluzione dei vettori di clonaggio: si tende a farli più piccoli perchè sono più maneggevoli, più facili da estrarre, è più facile introdurli in un batterio e inoltre vengono aggiunti i multi cloning site sempre più completi per poter usare l'enzima di restrizione più conveniente
      - esempi di vettori
        
        PBR322: vettore primitivo con 20 siti di restrizione e due geni di resistenza, Amp e Tet
        
        pUC19: plasmide di espressione resistente ad Amp con sito di policlonaggio in Lac Z per poterlo saggiare in alfa complementazione