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ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI (1 rottura della membrana e…
ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
1 rottura della membrana e della parete
materiale biologico di partenza
nel caso di batteri è necessario centrifugare per rimuovere il terreno di coltura
nel caso di tessuti più complessi è necessaria una frammentazione ed omogenizzazione
procarioti
lisozima per indebolire il peptidoglicano
detergenti ionici come l'SDS per solubilizzare i lipidi di membrana
EDTA come agente chelante necessario per il funzionamento di alcuni enzimi come DNasi
eucarioti, animali
tamponi ipoosmolari e detergenti ionici o non ionici
eucarioti, piante e funghi
metodi enzimatici per la digestione della parete
metodi fisici come pestaggio con il mortaio, cicli di scongelamento e congelamento
2 separazione da altre componenti cellulari
rimozione delle proteine
la prima cosa da fare perchè gli enzimi possono degradare il DNA e alcune proteine vi si possono legare inficiando i procedimenti successivi
si utilizza una soluzione acquosa con tampone e fenolo, si formano due fasi
se si utilizza un tampone neutro o alcalino DNA ed RNA si dispongono sulla parte acquosa dell'interfaccia tra le due fasi
se si utilizza un tampone acido troviamo l'RNA sulla facciata della fase acquosa e il DNA sulla facciata fenolica
è importante lavare con cloroformio per evitare eventuali residui di fenolo.
e lavare con etere (che evaporerà) per rimuovere il cloroformio
rimozione di altre componenti
si fanno precipitare gli acidi nucleici con alcol
esistono anche kit di purificazione a base di
resine a scambio ionico
matrici silicee
gel filtration
ultrafiltrazione
3 separazione degli acidi nucleici
DNA
trattamento con RNasi e precipitazione selettiva con isopropanolo a temperatura ambiente
otteniamo DNA plasmidico e genomico
separare DNA genomico da quello plasmidico: si procede con una denaturazione moderata a pH basico, il DNA genomico si denatura irreversibilmente e una volta riportato a pH neutro forma un reticolo, i plasmidi invece si rinaturano velocemente e si può sfruttare la differenza di peso per distinguerli
RNA
trattamento con DNasi e precipitazione selettiva con LiCl
otteniamo RNA messaggero e gli altri
per ottenere mRNA si purifica per affinità sulla cellulosa
tecniche di ibridazione
utili per individuare specifiche sequenze all'interno del DNA (southern blotting), RNA (northern blotting) o proteine (western blotting)
si utilizzano sonde radioattive e non per evidenziare le sequenze
FISH: ibridazione in situ fluorescente, consente di individuare specifiche sequenze su cromosomi o porzioni di tessuto tramite sonde molecolari. Utilizzato per individuare malattie cromosomiche