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LIBRERIE E SEQUENZIAMENTO (librerie (cosa sono (collezioni di cloni…

- - - - collezione di cloni che rappresenta i geni che vengono espressi in un organismo
      - sono utili quando si vogliono studiare le proteine espresse da un organismo. La sequenza amminoacidica è facilmente ricavabile dalla sequenza nucleotidica
      - il cDNA si ottiene per retrotrascrizione dall'mRNA
      - negli eucarioti con questo sistema si analizzano solo le sequenze esoniche
    - - collezione di cloni che rappresenta l'intero genoma di un organismo
      - sono utili quando si vuole sequenziare l'intero genoma di un organismo e si vuole studiare l'espressione genica dal momento che comprende i promotori e le sequenze di regolazione
  - - - dove N è il numero di cloni analizzati, p è la probabiilità 0,99 ed f è la frazione del genoma rappresentata da un clone medio (media delle dimensioni degli inserti / dimensione del genoma)
        
        la media delle dimensioni degli inserti dipende dai VETTORI DI CLONAGGIO. ognuno ha i suoi vantaggi e svantaggi, il parametro più importante da considerare è proprio la lunghezza dell'inserto che può accettare. Dall'alto sono in ordine da quello che accetta inserti più piccoli a quello che accetta inserti più grossi:
        
        cosmidi
        
        BAC
        
        fagi
        
        YAC
        
        plasmidi
  - - - frammentazione del DNA genomico
        
        digestione parziale (genera frammenti sovrapposti)
        
        digestione totale (non genera frammenti sovrapposti)
        
        rottura meccanica
      - clonaggio dei frammenti nel vettore
      - trasformazione di batteri o lieviti
      - determinazione della qualità della libreria
      - screening
    - - deve possedere tutti gli mRNA di un tessuto, anche quelli più rari
      - estrazione dell'mRNA
      - retrotrascrizione
      - sintesi dell'altro filamento di DNA
      - trasformazione di batteri
      - determinazione della qualità della libreria
      - screening