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CH8 基因轉殖及基因剔除技術第10組 (8-2 基因轉殖 (一、基因轉殖小鼠之製造流程 (設計轉殖基因(transgene)…

- - - - 包含可使基因表現的所有條件
        
        啟動子(promoter)
        
        可控制基因之表現
        
        編碼區域(coding region)
        
        可經由轉錄和轉譯過程而產生基因產物－蛋白質
    - - 以基因選殖方式得到我們要的轉殖基因株後，再把轉殖基因DNA片段從質體分離純化出來
        
        把轉殖基因DNA打入單細胞之受精卵
        
        打入受精卵之轉殖基因DNA會隨機地插入染色體的任何一個位置，並隨著染色體進行複製而遺傳至小鼠體內的每一個細胞，如此便得到基因轉殖小鼠(transgenic mice)
    - - 首先要取得小鼠之基因體DNA (genomic DNA)
        
        最常見之篩選方式是利用PCR技術，設計一組可特異地增幅出屬於轉殖基因部分序列的引子，即可以此方式篩選出帶有轉殖基因之小鼠。
        
        也可以南方墨點實驗(Southern blot)來偵測轉殖基因，只要以轉殖基因當作探針，即可在轉漬膜上測出含有轉殖基因的片段，而且以此方式更可計算出有多少套數(copy number)的轉殖基因。
- - - - 功用: 一種用於在細胞DNA的特定位點上進行刪除、插入、轉座和倒位操作的位點特異性重組酶技術，其特點在於可以讓DNA修改對指定的特定細胞群進行，或是使修改過程由特定的外部刺激所觸發。
        
        在P1噬菌體中發現的位置特異性重組酶（site-specific recombinase）。重組酶的功能在於催化基因序列重新組合；而位置特異性則意指這些重組酶會辨識基因序列上的特定排列組合來重組基因片段。
  - - - (四)產生基因剔除小鼠
        
        將篩選後的ES細胞已顯微注射打入囊胚接著轉移到假懷孕母鼠的子宮內,ES細胞(灰色)+野生型細胞(黑色)會發育成一個混合個體,稱為嵌合體
        
        可以從非黑色毛色判斷ES細胞發育成生殖細胞的機率
        
        和ES細胞同樣的篩檢方法來篩檢嵌和小鼠後代,得到單套基因剔除小鼠在互相交配,能有四分之一的機會得到相同基因剔除小鼠
        
        應用
        
        觀察活體內基因表現
        
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        非黑色越多,ES細胞佔嵌合體越大,發育成生殖細胞也越高,可將剔除的基因遺傳至後代的機會也就越大
        
        ES細胞帶顯性非黑色毛色基因,囊胚細胞帶隱性黑色毛色基因,而ES細胞可分化成任一個細胞,因而產生嵌合小鼠(毛色黑或不黑)
      - 作法為在設計標的載體時也要同時設計限制酶切割位置
        
        利用切割出不同長度之DNA片段,分辨出同源重組ES細胞
        
        PCR也能篩選,其引子設計是一個位於neo內,另一個位於載體以外之標的基因序列上
        
        非同源重組ES細胞(做不出PCR產物)
        
        同源重組(可做出PCR產物)
        
        應用
        
        ES細胞複製技術很強動物人都可以尤其是老鼠,能能用在再生醫學
  - - - 所以為了研究基因在生物體內之中藥性，而發展出了基因剔除的技術。
        
        基因剔除（英語：gene knock-out，縮寫為KO）是一種遺傳工程技術。
        
        是指利用外源的已突變的基因通過同源重組的方法替換掉內源的正常同源基因，從而使內源基因失活而表現突變體的性狀的技術或方法。
        
        不僅可看出此基因對生物體的重要性，也可用來研究基因缺陷造成的各種發育或是生理上的問題。
        
        應用
        
        小鼠基因剔除技術
        
        有兩個重要的條件
        
        2.同源基因重組
        
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        1.ES細胞培養
        
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        主要用於了解該基因在生物體扮演的角色或功能。另一種方法是gene enhance，可加強該基因的表現量。兩者互相比較與對照。可以更加清楚的知道該基因的功能。
        
        先由馬里奧·卡佩奇、奧利弗·史密斯於 1987年構建成功，他們因為這一成就於 2007 年同小鼠幹細胞分離技術創始人馬丁·埃文斯分享了 2007年的諾貝爾生理學或醫學獎。
        
        (ㄧ)設計標的載體
        
        包含了三的要素
        
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        (二)發生同源重組的ES細胞
        
        構築好標的載體後，一般是以較高效率的電穿孔方式將標的載體送入ES細胞中。
        
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- - - - 睡美人跳躍子
        (sleeping beauty,簡稱SB)
        
        原本在鮭魚基因體內
        
        1997年，將其改造，可在人類細胞株基因體中在跳躍
        
        2005年，成功利用SB進行小鼠的突變篩選
        
        插入位置在TA序列
        
        目前有改良的跳躍酶(SB11)基因，可產生更大量的跳躍酶，配合更多連續SB(T2/onc2)，在基因體內可跳得更多更廣
        
        目前跳躍頻率仍不高，不足進行大規模的篩選突變
      - PB跳躍子
        (PiggyBac，簡稱PB)
        
        原本在菜蛾基因體內
        
        可攜帶14kb的DNA
        
        在果蠅等生物中可任意跳躍、插入，沒特定區域，只需要TTAA序列
        
        2005年，中國的復旦大學成功將這系統運用在人類細胞株及小鼠的轉殖上
  - - - 主要工作
        
        製造突變鼠
        
        建立快速疾病表現型的篩選方法
      - 目的
        
        幫助各個研究單位找出人類疾病的相關基因
        
        建立疾病的動物模式
        
        開發與疾病相關的預防和治療方法
- - - - 内細胞質團具有多元分化的能力，可以分化成胚胎的各個構造，ES細胞就是從内細胞質團培養而來