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第二組 Ch8基因轉殖及基因剃除 (8-3基因剔除 (原理和應用 (Genome engineering /Genome editing…

- - - - 利用化學誘變或轉位子導致的突變來研究基因功能，但是這些篩選不能進行特定位置的修飾。同源重組所造成的基因剔除或剔入，雖然可以準確地對特定基因進行修飾但其操作步驟多，且效率偏低，通常低於1×10的6次方{A}，而基因干擾技術也存在著無法將基因表現完全中止的缺點。
        
        基因组编輯(genome editing)技術[B]主要依賴一些識別特定序列的核酸酶在DNA上切割，造成雙股DNA斷裂，進而利用非同源末端接合機制(NHEJ)或同源重組機制(HR)來修復DNA斷點，HR可針對斷點複印的基因序列進行序列置換(HDR)。
    - - 非同源末端連接修復機制並不精確，極易發生錯誤(缺失/插入)進而造成移碼突變，因此可以達到基因剔除的目的。如果刪除或插入的DNA片段的鹼基樹正好是3的倍數，也可能因氨基酸的缺失或增加，對蛋白的功能有影響。雙股DNA斷點產生後，若同時存在模板DNA序列，通過同源重組的作用，可以根據所設計的模版，插入特定的一段序列(knock
        in)、刪除特定的序列來突變特定的鹼基或序列。引入的模板序列可以是單股DNA，也可以是帶有長的同源臂的雙股DNA。因雙股DNA斷點的存在，可提高在DNA斷點處同源重组的機率，而增進了基因
        组编辑的效率。同源重组修復機制發生的機率要比非同源末端接合機制低，但由於該機制在修復的過程中有同源性模板，因此可以實現準確的突變。
        
        Ex:Cer/LoxP、ZFN、TALEN以及CRISPR系統
    - - 是一種人工改造的限制性內切酶，將TALE的DNA結合區與限制性內切酶(Fok I)的DNA切割區融合而得到。TALEN在細胞中與基因靶為點結合，形容二聚體發揮內切酶活性，導致spacer區域發生雙股DNA斷裂(DSB)而誘發非同源性末端接合機制或同源重組機制修復DNA，達到基因剔除的目的。
    - - CRISPR系统是细菌在噬菌体長期選擇壓力下演化出來的一種有效抵禦外源 DNA 入侵的免疫機制，分為三種類型，其中第二種型CRISPER/Cas9系統是透過Cas9/tracrRNA/crRNA複合體去辨識與切割互補DNA，由於此複合體構造較為簡單。
    - - 為了解決脫靶效應，進一步改造Cas9成為突變型Cas9n (D10A突變又稱nickase)。此種方式由於需要兩個guide RNA同時辨認才能剪切，可有效降低脫靶的問題。將Protospacer序列縮減為18或19nt，發現也可以降低脫靶效應至5000倍。
  - - - 2.產生發生同源重組(或基因剔除)之ES細胞
        
        3.篩選發生同源重組(或是基因剔除)之ES細胞
        
        4.產生基因剔除小鼠
- - - - 這是原本在鮭魚基因體中的跳躍子 , 在一千四百萬年前插入基因體之後累積一些突變 , 就不再動了 , 像沉睡了一般
      - 但目前而言 , 他的跳躍頻率仍不太高 , 不足以進行大規模的篩選突變
    - - 在果蠅等生物中可以任意跳躍、插入 , 而且沒有特定的區域 , 只是需要TTAA序列
      - 相較於SB , PB在整個基因體中均可以可以任意跳躍
      - 這是原本在菜蛾基因體中的跳躍子 , 可以攜帶14kb的DNA
- - - - 設計轉殖基因
        
        產生基因轉殖小鼠
        
        篩選基因轉殖小鼠
        
        可使用
        
        南方墨點實驗(Southern blot)
        
        計算出有多少套數的有多少套數的
        轉殖基因
        
        1 more item...
        
        PCR
        
        篩選出帶有基因轉殖的小鼠
  - - - 在不該表現的地方表現
  - - - 文章連結
- - - - 8~12個卵
        
        以懷孕母馬血清性腺激素PMSG代替(pregnant mare's serum gonadotropin)
        
        4~6週之母鼠
        
        20~30個卵
    - - 8~12個卵
        
        以人類絨毛膜性腺激素hCG代替
        (human chorionic gonadotropine)
        
        4~6週之母鼠
        
        20~30個卵
  - - - 0.5~2.5天為分裂期
        
        3.5天內部的緊密細胞天發育成內細胞質團ICM(inner cell mass)外部細胞發育成滋養外胚層(trophectoderm)
        
        胚胎稱之囊胚(blastocyst)
        
        4.5天胚胎著床子宮，胚胎發育進入原腸胚形成(gastrulation)
        
        發育至第19.5天成一完整個體
        
        ICM具有多分化的能力
        
        ES細胞胚胎幹细胞（embryonic stem cell)Martin G R以免疫外科法剝離小鼠囊胚滋养层细胞，得到内细胞團(ICM)並將其置於STO细胞飼養層上，培養基為小鼠PSA-1 ES细胞條件培養基，结果也得到小鼠ES细胞