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第一組 Ch8 (8─3基因剔除 (〈1〉設計標的載體 (2.正向篩選標記：一般是使用抗藥性基因，常用標記為抗新黴素基因〈NEO〉，篩選方法在培養…
第一組 Ch8
8─3基因剔除
〈3〉篩選發生童原重組之ES細胞
雖然正向和負向篩選標記可以幫助挑出發生同源重組之ES細胞，但這些篩選標記的效果並不是百分之百，因此需要以南方墨點實驗進一步篩選確認有同源重組之ES細胞，做法是在設計標的載體時也要先同時設計限制酶切割位置，在篩選時，使用此限制酶來切割ES細胞之基因體DNA，利用切割出不同長度之DNA片段來分辨出同源重組之ES細胞。此外，PCR也可用來篩選有同源重組之ES細胞，其引子之設計是一個位於neo內，另一個位於用作標的載體以外之標的基因序列上，如此才可分辨出是非同源重組之ES細胞（做不出PCR產物），或是同源重組（可做出PCR產物）。
此外，PCR也可用來篩選有同源重組之ES細胞，其引子之設計是一個位於neo內，另一個位於用作標的載體以外之標的基因序列上，如此才可分辨出是非同源重組之ES細胞（做不出PCR產物），或是同源重組（可做出PCR產物）。
〈2〉產生發生同源蟲組之ES細胞
構築好標的載體後，一般以效率最高之電穿孔方式將標的載體送入ES細胞中。篩選帶有載體EA之細胞，用G418來篩選帶有NEO的ES細胞。同時利用正向和負向篩選標記，便可篩選出有同原重組之ES細胞。改變特定染色體基因的方法，叫做基因標的法；造成基因功能破壞之改變，叫基因剃除。
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〈4〉產生基因剃除小鼠
得到基因剔除之ES細胞後，如圖8-5，將此ES細胞以顯微注射打入囊胚(blastocyst)，再將此囊胚移至假懷孕母鼠的子宮內，ES細胞（灰色）會和野生型之囊胚細胞（黑色）混合，發育生長成一個混合之個體，稱為嵌合體(chimera)。
由於ES細胞帶有顯性非黑色毛色基因(Agouti)，囊胚細胞帶有隱性黑色毛色基因(nonagouti)，而ES細胞可分化成任一個細胞，因此產生之嵌合小鼠(chimeric mice)身上的毛色有可能是黑色，也有可能是非黑色
我們可以非黑色毛色的比例來判斷ES細胞發育成生殖細胞的機率，因為如果非黑色毛色越多，代表ES細胞佔嵌合體的比例越大，ES細胞發育成生殖細胞的機率就越大，如此可將剔除之基因遺傳至後代的機會也就越大。
經由和ES細胞同樣的篩選方法來篩選嵌合小鼠之後代（如南方墨點實驗或PCR），得到單套基因剔除小鼠(heterozygous gene knock-out mice)後，再使其互相交配，即可有四分之一的機會可得到同型基因剔除小鼠(homozygous gene knock-out mice)。
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8-4 Gene Mutation
- ENU (n-ethyl-n-nitrosourea)
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There are many small DNA hops in organisms, which can be inserted anywhere in the genome.
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When the jumping enzyme is not present, SB will not jump.
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- PB jumper (PiggyBac, referred to as PB)
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will not cause various effects caused by virus insertion into the genome, and may have the opportunity to replace viral vectors as a new generation vector for gene therapy
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