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第九組 Ch6 Restriction Enzyme and Other Modification Enzymes (Klenow片段 (合成…
第九組 Ch6
Restriction Enzyme and
Other Modification Enzymes
6-3限制酶的選用
迥文序列：雙鏈DNA中的一段倒置重複序列,當該序列的雙鏈被打開後,可形成局部"十"字形結構.這段序列被稱為迴文序列
四個鹼基對(Haeiii)
缺點:出現太頻繁，DNA片段太小太碎，不容易利用
六個鹼基對(EcoRi)
最常使用的一種，每種核苷酸組合平均在4096bp，容易利用
八個鹼基對(Noti)
序列太難出現，無法利用
更多鹼基對
非迥文序列
五個鹼基對(如Ddei)
在某些位置是任一種嘌呤(A、C標示為Pu)
在某些位置是任一種嘧啶(T、G標示為Py)
四種均可的(標示成N，如Ddei)
依據切口分類
平端(blunt end)
接合成功率較低
突端(sticky end)
接合的成功率較高
線形化(linearize):如果質體只有一個切口，切開的質體便從圓形成為線形的步驟。
6-1限制酶的發現
限制酶
來自細菌的一種酵素
能認識特定DNA序列的酵素蛋白
可切斷外來質體
防止已入侵質體在細菌體內任意複製
確保自己幾吋體不受其他細菌的DNA感染
1970,純化出第一個限制酶Hindil
廣泛應用在基因工程技術或生化技術
6-7與RNA有關的核酸水解酵素
RNase H
認識DNA-RNA雜交物，將其中的RNA部分水解
與反轉錄酶在一起作用
不切單股核酸、雙股DNA、雙股RNA
RNase A
切在單股RNA中嘧啶的3'端
作用在RNA-DNA或RNA-RNA中露出的單股RNA中
能將RNA切碎
S1 nuclease
認識RNA-DNA，將其比RNA5'端長出的DNA部分水解
可以定出5'RNA相對應的DNA序列位置
常被用來定出mRNA轉錄起點的酵素
RNase T1
切在G位置的3',同樣能將RNAf切碎
能將RNA切碎
RNaseⅢ
可識別dsRNA並將其在特定的靶標位置裂解以將其轉化為成熟的RNA。
RNase P
剪切tRNA分子中RNA上多餘的或前體的多餘序列
6-2 限制酶的命名
命名根據
取材來源的菌種學名
R表從RY13品系純化
Eco示大腸桿菌
對稱序列(迴文序列)
從3'或是5'端順序都是相同的
何謂限制酶
具有專一性
核酸水解酶(nuclease)
內切核酸酶(endonuclease)
直接切在DNA的中間
RNaseⅢ
RNase A （1、2、3、4/5）
RNase T1
RNA誘導沉默複合體
RNase P
RNase H（1、2A、2B、2C）
外切核酸酶(exonuclease)
從DNA的3'端開始將核甘酸一個一個切除
寡核苷酸酶
能切DNA或RNA的酵素
水解
是物質與水反應，利用水形成新的物質的過程
DNase l - DNA水解酵素I
是一種可以消化單鍊或雙鏈DNA產生單脫氧核苷酸或單鍊或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶
水解單鍊或雙鏈DNA後的產物，5'端為磷酸基團，3'端為羥基
DNase I活性依賴於鈣離子，並能被鎂離子或二價錳離子激活
鎂離子存在條件下，DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點
二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端
DNase l蛋白質足跡實驗
(DNase l footprinting)
是一種鑑別RNA 聚合酶等蛋白質在DNA上結合位點的方法，它不僅能找到與特異性DNA結合的目標蛋白，而且能告知目標蛋白結合在哪些鹼基部位
實驗流程
①待檢雙鏈DNA分子作末端標記，通常只標記雙鏈其中一條鏈的一端
②蛋白質與DNA混合，等兩者結合後，加入適量的DNase I ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之達到每個DNA分子只發生一次磷酸二酯鍵斷裂，並列設置未加蛋白質的對照
③從DNA上除去蛋白質，將變性的DNA加樣在測序凝膠中作電泳和放射性自顯影，與對照組相比後解讀出足跡部位的核苷酸序列
Exonuclease lII - DNA外切水解酵素III
作用於雙鏈DNA，沿3'→5'方向逐步催化去除單核苷酸，每次酶與底物結合催化，只有幾個核苷酸被除掉，從而在DNA分子群內產生漸進缺失
Exonuclease lII的活性部分依賴螺旋結構並根據序列的不同而有差異(C>A=T>G)
溫度、鹽濃度和酶與DNA的比例對酶活性影響很大
應用
刪減突變株
定點突變
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TDT)
常用在標記DNA的3’端，或加上單種核苷酸長串供黏用
不需要另一股作為模板，但是需要有限制酶或其他核酸酵素先將DNA切成3’突端
可以在任何單股DNA突出的3’端連續加上10~40個長串供黏合用
T7 RNA Polymerase 及T3RNA Polymerase
從不同的噬菌體中純化的RNA聚合酶，只要提供正確的啟動子，便可轉錄出下游的RNA常被利用為體外轉錄（in vitro transcription)系統
Taq DNA Polymerase
它的耐熱性，可以在DNA加熱至95°C變性以便分開雙股螺旋時，仍具有相當活性，因此DNA模板可以不斷再被引子黏合，反覆這種連續性的聚合反應。
從硫磺中的細菌中純化出來的，PCR(polymerase chain reaction) 中使用的聚合酶
Reverse Transcriptase （反轉錄酶）
DNA為模板，反轉錄出DNA，許多RNA病毒都有的酵素，獨特性完全不同於傳統的DNA→RNA的觀念，以mRNA為模板反轉錄出cDNA
常用的反轉錄酶是取材自病毒AMV及MLV
Klenow片段
合成 cDNA的第二股
當以mRNA當模板，利用反轉錄可以作出cDNA，這只是單股的DNA，再利用Klenow片段即可以合成第二股DNA，如此，就得到完整的cDNA
體外突變
利用合成的單股突變寡聚核苷酸作為引子，Klenow片段可以繼續合成質體，而突變的寡聚核苷酸即成為質體的一部分，便產成帶有突變的質體
單股探針
當以mRNA當模板，利用反轉錄可以作出cDNA，這只是單股的DNA，再利用Klenow片段即可以合成第二股DNA，如此，就得到完整的cDNA
Random priming
另一個標記探針的方法，以隨機組合的六個核苷酸長度的寡聚核苷酸當成引子，即可從DNA的隨機位置開始合成DNA探針
解讀 DNA 序列
用特別標記的dNTP，Klenow片段就能依據模板合成可解讀的序列
補齊
將DNA片段5'突端補成平端以利接合
T4 DNA 聚合酶
6-6具有外切酶功能的核酸水解酵素
6-5其他核酸聚合酶
6-4切口修飾酵素
