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Ch5基因選殖 (質體 (原生質體所帶的基因 (原本就存在的原生植體許多都帶有抗藥性基因，成為生物技術上十分有用的工具,…
Ch5基因選殖
基因選殖的基本流程
限制酶
可以認識特別的DNA，將質體DNA切開，選殖的片段接入
接合酶、其他酵素
將以切開的質體與選殖片段接誠心質體
質體
選殖位置(MCS)
殖基因接入
複製原(Ori)
細菌中大量複製
耐抗生素基因(Ampr)
選殖出帶出有此殖體的細菌株
勝任細胞
接受外來質體的能力足以勝任
酵素
接合酶
當選殖的基因片段要接入以切開的質體時
切口修飾酵素
想將不能直接吻合的兩個酵素切口相接
5'突端
利用Klenow將它補齊
3'突端
利用噬菌體T4的DNA聚合酶將它修平
限制酶
選殖
分析質體
勝任細胞
電穿孔
提高細菌吃入DNA能力
細菌品系的選擇
選用正處於生長旺盛期的健康細菌
CaCl2 Transformation
與DNA混合後，以短時間的瞬間熱處理使細菌吃入DNA
質體
圓形DNA
episomic
原生質體所帶的基因
原本就存在的原生植體許多都帶有抗藥性基因，成為生物技術上十分有用的工具
具有經濟價值的質體，例如鏈球菌或其他相關菌種帶有一些發酵必需的酵素基因，是製造乳酪所必需的
複製源起點及複製力
複製原的定義為DNA複製起點及相關調控元素的單位
容易就可以利用細菌繁殖出大量的質體，十分方便於量產
抗藥性基因
原本不具抗藥性的細菌因為得到了這個質體而產生了抗藥性，這個現象稱作細菌轉型。這種轉型的細菌可以由一個細菌不斷生長分裂，長成一個菌落
載體的種類
載體
通常用來裝載選殖基因的這個質體稱為載體
有時標記成PCS或MCS，指的都是相同的東西，這些序列並不是質體本身所必備的，是人為改造成方便接入選殖基因用途的
基因選質的篩選
第一階段(選定基因)
以抗生素篩選
存活者之‘耐抗生素基因’即為標記
第二階段(判斷DNA植入與否)
IPTG-X-gal藍白試驗
轉質成功者將無法製作分解X-gal之酵素
轉質成功＝白色
轉質失敗＝藍色
細菌電泳
溶解細胞膜，直接觀察植體大小判斷是否轉接成功
第三階段(確定產物)
各種類限制酶
盡量將頭尾選擇不同種類的限制酶來切位，以免選殖片段倒置，降低成功率
質體接合原理
相合的突端相接時需要的接合酵素約為平端相接的1/10
考慮適當的載體與插入子的分子比例
分子碰撞
相合的突端相接較平端相接容易
突端接合與平端接合共存時，先接突端
