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基因選殖第05組 (5-3酵素 (接合酶 (當選殖的基因片段要接入已切開的質體時，必須要有接合酶來進行這個接合的動作,…
基因選殖第05組
5-3酵素
限制酶
限制酶在質體上只有一個切口，切開的質體會從圓形變成線型，這個步驟稱線型化(linearize)
至少要有2個限制酶切口，才能將質體分成2個片段
1.在基因選殖時，常用限制酶將DNA切開
2.在分析質體時，也會利用這個工具來判定質體是否帶有選質的基因片段
接合酶
當選殖的基因片段要接入已切開的質體時，必須要有接合酶來進行這個接合的動作
兩者接合時，提供新質體大部分架構的質體可被稱為載體(vector)，而選殖片段則稱為插入體(insert)。
二者的限制酶切口必須能互補配對吻合才能接合。
通常由相同的限制酶所產生的切口最方便，直接就可以接合。即使來自不同限制酶所產生的切口，只要互相吻合，也是可以接合的。
切口修飾酵素
若想將不能直接吻合的兩個酵素切口相接，我們需要將切口整修成平端的方式來解決。
對於5'突端，一般是利用Klenow將它補齊(fill-in)，這是DNA複製時的主要酵素DNA聚合酶I中的部分具活性之酵素片段。
由於自然的DNA複製是由5'端往3'端，因此對於3'突端，是沒有可利用的酵素能直接將缺口補齊的，而是要利用噬菌體的T4 DNA聚合酶將它多出的3'端核苷酸修剪成平端。
5-4勝任細胞
化學方式
CaCl₂ Transformation
經 CaCl₂ 處理過的細菌，其細胞膜通透性增加，與DNA 混合後以短時間的瞬間熱處理，DNA便會被細菌吃入。
大約每 μg DNA 可以讓 10⁷ 個細菌得到質體。
便宜簡單且常用的方法。
物理方式
電穿孔
細菌經連續的低張溶液處理，與 DNA 混合後接上電極，經由瞬間電流使細胞膜暫時通透，就可以將 DNA 送入細菌。
可讓 80% 的細菌具有轉型能力，幾乎可達10⁹ / μgDNA 的轉型效率。
有效且可靠的方法，但機體設備較為昂貴。
細菌品系的選擇
選用正處於生長旺盛期的健康細菌。
現在被用來作實驗的大部分都是大腸桿菌。
各種品系有不同特性，如防止細菌發生基因重組或突變。
5-1基因選殖的基本流程
利用的工具
限制酶
接合酶及特別酵素
質體
耐抗生素基因
選殖出帶有此質體的細胞株
選殖位置
提供選殖基因接入位置
複製原
才能在細菌中大量複製
勝任細胞
基因選殖流程
2.目標基因切割
3.重組載體
1.載體基因切割
4.轉形宿主
5.重組載體複製
6.宿主細胞培養
5-6質體結合原理
設計質體及接合的原則
分子碰撞：分子內自行接合易於分子間接合。
突端接合與平端接合共存時，先接突端
相合的突端相接時需要的接合酵素約為平端相接的1/10
考慮適當的載體與插入子的分子比例
相合的突端相接較平端相接容易
結論
基因選殖其實是一項簡單而實用的技術，並沒有高深的學問或特別的技巧。後續章節，即可了解基因選殖只是許多技術的其中一個步驟。由此可知，許多技術都需要利用到基因選殖，可見此技術之重要性及基礎性
5-5基因選殖的篩選
使用抗生素做第一步的篩選，
能活下的就是帶有質體的
5-2質體
複製原起點及複製力
複製原的種類會決定質體在細菌中存在的數量多寡
細菌複製圓形的質體時，都會由固定的起點開始
原生質體所帶的基因
許多原生質體都帶有抗藥性基因
鏈球菌帶有酵素的基因，
是製造乳酪的必需品
載體
用來裝載選殖基因的質體稱為載體
在短短的序列中密集分部有很多種常用限制沒認識的序列，以便選質利用，稱作polylinker site
抗藥性基因
原本不具抗藥性的細菌因為得到了質體而產生抗藥性，稱作細菌轉型
載體的種類
利用氏菌體P1載體，利用染色體為架構的BAC、YAC，這類載體主要是為了裝載價大的DNA片段，用來構築基因庫之用
IPTG-X-gal 藍白試驗:
在培養基上塗有該酵素的受質X-gal及誘導產生酵素的IPTG
第三階段
確定接入的DNA是我們想要的
以限制酶將接入的DNA片段切出來，觀察它的大小是否相符，或是該DNA片段上是否有特定的限制酶切口來判斷。
在某些情況下，質體並未如我們預期一般接入我們想要的DNA，而是接入其他的DNA片段。
細菌電泳
實驗室的質體都經過很多步驟的剪剪接接，
不再能用第一種方法來判斷，此時，還可以取少量的菌落溶解在特殊的溶液中，除去細胞壁直接在進行電泳分析時溶解細胞膜，可依其位置大小來判斷質體是否長大了一些。
第一階段
第
二
階
段
