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ch5 Cloning (基因選殖) 第09組 (質體接合原理 (分子碰撞 (分子內碰撞 (兩端點碰撞，接合機率高), 分子間碰撞…
ch5 Cloning
(基因選殖)
第09組
5-1基因選殖基本流程
限制酶(restriction)
接合酶(ligase)及其他特別的酵素
質體(plasmid)
耐抗生素基因
選殖位置(multiple cloning sites)
複製原(ori)
勝任細胞(competent cell)
5-4 勝任細胞
勝任細胞的處理方式
物理方式
電穿孔
化學方式
CaCl2 Transformation
細菌品系的選擇
選取生長旺盛期的細菌
通常以大腸桿菌為主流
質體接合原理
分子碰撞
分子內碰撞
兩端點碰撞，接合機率高
分子間碰撞
不同分子碰撞，接合機率低
突端較平端相接容易
需要的接合酵素
突端:平端=1:10
突端的接合易於平端
需考慮載體及插入子的分子比例
基因選殖的篩選
第二階段
IPTAG-X-gal藍白試驗
接入轉殖基因
質體的MCS區遭破壞，無法做出β-gal的蛋白質
未接轉殖基因
質體的MCS區完好，可做出 β-gal的蛋白質
細菌電泳
第一階段
用抗生素做第一階段篩選，確認該細菌帶有質體
第三階段
質體的純化
5-3酵素
接合酶
基因片要接入切開的質體需使用接合酶
結合時被稱為載體
不同限制酶所產生的切口，只要吻合，也可以接合
限制酶
線形化：切開的質體從圓形變成線形
基因選殖時將DNA切開
切口修飾酵素
對於5'一般是用kelenow 將它補齊
將不能吻合的切口相接，需將切口整修成平端的方式