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Coleta de amostras ambientais (Água e solo úmido utilizando tubos (15mL)…
Coleta de amostras ambientais
Água e solo úmido utilizando tubos (15mL) estéreis
Mantidas refrigeradas, em seguida congeladas a -20°C até o seu processamento.
Tratamento de amostras ambientais
Amostra divididas em dois grupos
Água livre de sedimentos
Serão inoculadas diretamente em culturas celulares de amebas.
Água com alta concentração de sedimentos e solo
Pré-tratamento com 4 volumes mais que a amostra de solução salina estéril Page’s (PAS);
Vortexados, decantadas por 24h á temperatura ambiente e filtradas;
Amostras serão estocadas à 4°C até os procedimentos
Plataforma celulares para o isolamento
Amebas de vida livre Acanthamoeba castellanii (ATCC 30010);
Inoculadas em garrafas de cultivo celular (T25) contendo meio extrato peptona glicose e antibióticos (PYGAC);
Mantidas à temperatura entre 31-33°C para o crescimento;
Quantificação do número de trofozoítos em câmara de Neubauer;
suspensão será centrifugada a 900g por 5 minutos, a 4ºC
sobrenadante descartado e o sedimento ressuspendido com 5mL de tampão fosfato salino (PBS).
Centrifugação, e sedimento será ressuspendido em 10 mL de meio PYGAC
Da amostra diluída, 10^5 de amebas será distribuído em novas garrafas de cultivo celular (T25).
Mantidas sob condições de crescimento, por 48 horas.