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TÉCNICAS MOLECULARES (PCR (Tipos (PCR múltiple (Amplificación de más de un…

- - - - Hongos
      - Bacterias
      - Virus
  - - - Amplificación de más de un fragmento de ADN en una sola reacción de PCR con dos o más juegos de primers
      - Búsqueda de varias deleciones, mutaciones y polimorfismos en un gen o múltiples
      - Análisis simultáneo de múltiples marcadores molecularer asociados a una enfermedad.
      - Detección simultánea de varios agentes patógenos, organismos genéticamente modificados, etc.
    - - Principio
        
        Detección del producto de amplificación mediante electroforesis
        
        Se utiliza un gen constitutivo (no se altera)
        
        Beta-actina
        
        ARNr 18S
        
        HPRT
        
        GAPDH
      - Resultado
        
        Intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de producto amplificado
        
        Longitud se verifica interpolando contra un marcador de peso molecular comercial de longitudes conocidas
    - - Permite reportar números absolutos (en una curva) de la cantidad de un microorganismo o del ARNm de un gen de una muestra.
    - - Solventa inconvenientes de PCR punto final
        
        Cambia método de detección del producto amplificado y temporalidad
        
        Misma reacción de amplificación
      - Detección de copias del producto
        
        Al mismo tiempo que la amplificación
        
        Mediante fluorocromos acoplados a primers
        
        Mediante sonda que hibrida primers
        
        Se degrada por acción de la exonucleasa 3'-5'
        
        Usos
        
        Mide cantidad de ADN sintetizado cada momento
        
        Fluorescencia proporcional a producto de PCR formado
        
        Permite conocer y registrar la cinemática de la reacción de amplificación
        
        Sistemas de detección
        
        Sondas TaqMan
        
        Termociclador para detectar fluorocromos por luz láser
        
        Cortas (se rompen por la ADN polimerasa)
        
        Libera fluorescencia
        
        SyberGreen
        
        Bajo costo
        
        Unión inespecífica a la doble cadena (fluorescencia).
        
        Diseño cuidadoso de primers
    - - Permite conocer niveles de ARNm
      - Realiza una relación entre la expresión del gen de interés con la del gen constitutivo
      - Porcentaje de expresión
      - Comparar con otras muestras analizadas
    - - Detecta presencia o ausencia de un fragmento de ADN determinado
        
        Diagnóstico de enfermedades infecciosas
        
        Resultados
        
        Negativo
        
        Positivo
    - - El producto se analiza después de 25-35 ciclos, antes de la saturación de la reacción por electroforesis.
      - Precisión pobre
      - Menor sensibilidad que PCR en tiempo real
    - - Mayor sensibilidad a la técnica
      - Proceso
        
        Iniciadores externos (ADN extensa)
        
        Contiene segmento que se desea amplificar
        
        Iniciadores internos (primers anidados, región pequeña).
    - - No requiere extracción del ADN del tejido.
      - Permite saber qué tipo celular presente en un tejido expresa un determinado gen o cuál célula está infectada por un patógeno.
    - - Con primers se hibridan secuencias con presencia de una mutación, en caso contrario no se produce PCR.
      - Control
        
        Heterocigenos
        
        Ambas reacciones positivas.
        
        Homocigotos
        
        Solo una delas reacciones es positiva.
  - - - Evaluar expresión o presencia
    - - Antes de PCR
      - Uso de transcriptasa inversa
    - - Detectar genomas virales compuestos por ARN
        
        Hepatitis C
        
        Influenza A
        
        VIH
      - Cuantificar ARNm de cualquier proteína en tejido
- - - - Basado en método enzimático de Sanger
        
        Suple marcaje radiactivo con métodos quimioluminiscentes con fluorocromos
        
        Para la lectura se usan sistemas ópticos para detectar los fluorocromos, mediante un robot.
        
        En tiempo real con curvas de cuatro colores
    - - Depende de la degradación química específica del ADN
      - Puede emplear ADN con doble hebra.
        
        Separación de hebras o fraccionamiento equivalente por cada fragmento de restricción.
        
        Eliminación de la base modificad
        
        Rotura de la cadena de ADN en la desoxirribosa modificada
        
        Modificación de una base
        
        Análisis de la secuencia fragmentada por electroforesis en poliacrilamida.
        
        Se lee de abajo hacia arriba (5'-3'
        
        Marcaje radiactivo del extremo 5' con 32P
      - Usos
        
        Mapear modificaciones de ADN
        
        Roturas
        
        Alquilaciones
        
        Identificación precisa de secuencias específicas de ADN que se unen a moléculas pequeñas y proteínas
        
        Para ADN que no puede secuenciarse
    - - Emplea análogos de dNTP (ddNTP)
        
        Actúan como terminadores
      - Principio
        
        Se aisla y clona ADN que se desea secuenciar
        
        Se desnaturaliza (usar una sola hebra)
        
        Secuenciación
        
        Iniciador-molde
        
        Cuatro partes con "didesoxi" correspondiente
- - - - Identificar fracciones proteicas
      - Proteínas particulares por tamaño
        
        Electroforesis de globulinas
        
        Proteínas séricas
    - - Analizar fragmentos cortados con enzimas de restricción (mapa de restricción)
      - Comparar tamaños de distintos tipos de ADN
      - Determinar tamaño molecular de ácidos nucleicos
      - Aislar y recuperar fragmentos de ADN purificados para clonaciones moleculares
      - Analizar productos de PCR
- - - - Un anticuerpo se une a dos elementos
    - - Anticuerpo inhibe, se fija en antígeno
    - - Antígeno+anticuerpo
- - - - Se usa un anticuerpo de captura (1) y anticuerpo de detección (2).
    - - Se utiliza anticuerpo primario no marcado y un anticuerpo secundario (marcado por una enzima) se une a este
    - - Es un ensayo basado en superficie / placa, donde la placa está recubierta con anticuerpos de captura reactivos a la molécula de interés. Se determinará la relación de unión.
    - - Anticuerpo conjugado directamente con una enzima.
        
        Si no hay kits ELISA disponibles comercialmente para su proteína objetivo.
- - - - Analizar ADN previamente digerido con enzimas de restricción Electroforesis e hibridación de secuencias específicas
      - Usos
        
        Determinar la presencia de gen o fragmentos del ADN.
        
        Identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética, mutaciones, polimorfismos,
    - - No se utilizan enzimas de restricción y se utiliza ARN. Electroforesis e hibridación de fragmentos específicos.
      - Usos
        
        Estudio de los productos de la transcripción génica (ARNm) y de su regulación.
        
        Variaciones
        
        Comparar condiciones clínicas normales o patológicas
    - - Usos
        
        Detectar deleciones, duplicaciones de segmentos pequeños (<1-2 Mb)
        
        Determinar diferencia entre dos muestras de ADN
        
        Número de copias
        
        Dosis genéticas existentes en tejidos neoplásicos con no neoplásicos
        
        Polimorfismo en número de copias
      - Array CGH
        
        CGH de alta resolución
        
        Muestra
        
        Muestra de control: colorante verde
        
        Muestra prueba: rojo fluorescente
        
        Proceso
        
        Se mezclan en cantidades iguales y se hibridan las muestras con una matriz de ADN genómico específicas que se coloca en grupos individuales en una superficie.
        
        Resultados
        
        Igualdad
        
        Amarillo
        
        Ganancia (secuencias): control > paciente
        
        Coloración más verde.
        
        Pérdida: control < paciente
        
        Coloración más roja.
    - - Usos
        
        Estudiar la presencia de la proteína en
        el extracto.
        
        Analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas
      - Principio
        
        Mediante electroforesis en gel se separan las proteínas (peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc.). Luego son
        transferidas a una membrana adsorbente para buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia.
    - - Usos
        
        identificación de componentes tisulares que pueden observarse al microscopio.
        
        Localización de secuencias génicas a nivel cromosómico.
        
        Detectar alteraciones cromosómicas
        
        Estudio de expresión de genes (ARNm) a nivel celular y subcelular
        
        Identificar infecciones virales en tejido
        
        Mapeo
      - Método histoquímico. Especificidad: unión de una sonda con una secuencia complementaria de ADN o ARN dentro de un tejido, no requiere extracción de ácidos nucleicos, en el tejido se lleva a cabo el procedimiento de detección e hibridación. Sondas radiactivas o no
    - - son
        
        Conjunto ordenado de genes de una superficie pequeña (10,000 por cm2)
      - Procedimiento
        
        Se fabrica una sonda para región específica
        
        Se coloca ADN
        
        Emite señal
        
        A: ADN control
        
        B: ADN muestra
        
        C: doble hibridación
        
        Negro o sin color: sin hibridación
      - Aplicaciones
        
        Determinar cambios a nivel de expresión de genes
        
        Análisis de mutaciones
        
        Polimorismos
        
        Diagnóstico de enfermedades precisas con bioarrays
        
        Desarrollo de fármacos y terapias
    - - Usos
        
        Detección de VPH-AR
      - Principio
        
        Las células cervicales se someten a una solución alcalina desnaturalizante que expone el material genético, identifican
        híbridos ADN con sondas de ARN, se identifican mediante anticuerpos específicos y una solución quimio-luminiscente en presencia de híbridos