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1.2 El laboratorio de biología molecular (El uso eficiente de los recursos…
1.2 El laboratorio de biología molecular
La técnica básica que se lleva a cabo en un laboratorio molecular es la
reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
El equipamiento
Equipamiento especifico
Equipo de electroforesis
Sirve para separar moléculas de ácidos nucleicos de distintos tamaños y permite analizar los productos amplificados en una PCR o purificar y obtener fragmentos de tamaños concretos de ADN.
Se lleva a cabo aplicando un campo eléctrico en una solución tampón en la que se sumerge una matriz que contiene las muestras de ácidos nucleicos. Estos migran con mayor o menos velocidad a través de la matriz en función de su carga neta que poseen.
La matriz que se utiliza es un gel de agarosa o piliacrilamida (cancerígena).
Soporte plastico
Cubeta de electroforesis
Zona de deposito de tampon de electroforesis en cada uno de los extremos.
Soporte central para la "cama" con gel.
Electrodos positivos y negativos en cada extremo.
Fuente alimentacion
Termociclador
Es el aparato en el que se lleva a cabo la PCR. Aparato básico en cualquier laboratorio de biología molecular.
Las partes mas destacadas son.
Bloque incubador
Es la parte mas importante. Se trata de un soporte metálico, con múltiples pocillos para colocar los tubos de reacción de PCR.
El rango de temperaturas que pueden alcanzar estos bloques normalmente va de 4ºC a 96ºC.
Tecnicas que se utilizan mediante sistemas de aire caliente o frió mediante resistencias o con el efecto Peltier.
Tapa del bloque incubador
Es una tapa termostatizada a 102-105ºC que, una vez cerrada, entra en contacto directo con la tapa de los tubos de reacción.
Documentador de geles
Es un equipo que permite visualizar las bandas de ácidos nucleicos en el gel después de la electroforesis y obtener una fotografía de el.
Transiluminador
. Consiste en una fuente de luz ultravioleta, situada debajo de una superficie transparente al UV donde se coloca el gel. (longitud de onda entre 245-365 nm),
Camara fotografica
Equipamiento genérico
Espectrofotometro
. La medida de la concentración de ácido nucleico de una muestra y su pureza requiera lecturas de absorbancia en un rango de longitudes de onda entre 230 y 320 nm.
Microscopio de luz transmitida y fluorescencia
. En biología molecular, es imprescindible para interpretar las técnicas de hibridacion in situ fluorescente.
Autoclave
. Imprescindible si se trabaja con microorganismos y aconsejables en cualquier caso.
Incubador o estufa
. La característica de los incubadores que se usan en el laboratorio de biología molecular dependen de las muestras que se estudien y de las técnicas que se apliquen.
Sistema de purificación de agua
. Requiere un suministro estable de agua purificada tipo II y agua ultrapura tipo I (para la extraccion ARN).
Baños termiostaticos, termobloque y placa calefactora
. Esta clase de equipamiento con regulación regulable es básico para realizar todo tipo de incubaciones, digestiones y tratamientos enzimáticos.
La placa calefactora, alcanza de manera homogénea y estable temperaturas de 95-100ºC para desnaturalizar el ADN de células y tejidos.
Centrifuga y microcentrifuga
. Tienen que tener rotores que permitan centrifugar desde tubos de 50 ml a Esppendorf de 0.2 ml.
Neveras y congeladores de -20ºC y -80ºC
. La mayoría de los reactivos se conservan a -20ºC. Las muestras de ARN y el almacenamiento de largo plazo de muestras de ADN debe realizarse a -80ºC.
Cabina de seguridad
. Se deben utilizar cabinas de flujo laminar vertical de clase II, que protegen de contaminación a la muestra, a la persona y al medio ambiente. Importante cuando se trabaja en
ARN
. Imprescindible si se trabaja con
cultivos celulares
.
Otros equipamientos
La estructura del laboratorio
Sala de preparación de reactivos
. Se considera una
área limpia
(sin ADN)
Sala de preparación de muestras y extracciones
Se considera una
área sucia
(con ADN)
Sala de PCR
. Dispone de los termocicladores para llevar a cabo la PCR.
Sala de post-PCR
Equipos de lectroforesis y de documentación de geles, sala sucia (con ADN).
El flujo de trabajo
. Marca el sentido unido de los procesos en el circuito de trabajo. El flujo de trabajo y de las muestras debe ser siempre unidireccional, desde area limpias a sucias.
pre-PCR → PCR → post-PCR
Las condiciones de trabajo
La contaminación de las muestras
. Hay que entenderlo en su significado mas amplio, como la introducción accidental en la muestra de material exogeno que altera su pureza. Los dos tipos mas peligros son:
Ácidos nucleicos extraños
y
Enzimas
.
Contaminación cruzada
Contaminantes de la superficie de trabajo.
Contaminantes procedentes del propio personal técnico de laboratorio.
Material no amplificado del medio ambiente o microorganismos ambientales. Caso de aerosoles generados durante la manipulación de muestras, apertura de tubos Eppendorf, etc.
Contaminación por productos amplificados
Generados mediante PCR en el propio laboratorio (carryover)
Contaminación de los reactivos comerciales y del material fungible
El termino estéril significa ausencia de microorganismos, pero algunos métodos de esterilización no garantiza la eliminación de ADN.
Normas para la manipulación de materiales y reactivos
Llevar un control exhaustivo de los reactivos y realizar controles negativos en todas las técnicas.
Técnica estiptica
- Es el conjunto de actividades encaminadas a prevenir la contaminación por microorganismos, ácidos nucleicos y nucleasas.
Lavado de manos
Uso de equipos de protección individual (EPI)
Descontaminación de superficies
Físicos como la luz UV.
Químicos como hipoclorito sódico al 10%
Prevención de contaminación ambiental
Cabinas de bioseguridad de clase II
Puntas de micropipetas especiales
Prevencion de carryover
. No revertir nunca el flujo de trabajo.
El uso eficiente de los recursos
Reactivos
Recursos humanos
Equipamiento e infraestructuras
Tecnicas
Gestión medioambiental