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2.5 Enzimas empleadas en biología molecular (Nucleasas (Son enzimas que…
2.5 Enzimas empleadas en biología molecular
Nucleasas
Son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace fosfodiester entre dos nucleotidos.
Clasificación
Punto de corte
Exonucleasas
, que eliminan nucleotidos uno a uno desde un extremo (en dirección 5' → 3', 3' → 5' o en ambas)
Endonucleasas
cortan en puntos intermedios de la molécula.
Tipo de ácido nucleido
(ARNasa o ribonucleasa). Romper enlaces fosfodiester entre ribonucleotidos.
(ADNasa o desoxirribonucleasa). Romper enlaces fosfodiester entre desoxirribonucleotidos.
Especialidad del corte
Aleatoriamente
Sitios concretos
Tipo de cadena
Monocatenaria
.
Bicatenaria
rompiendo enlaces en ambas cadenas.
Endonucleasas de restricción
Son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de ADN bicatenario y producen un corte en la doble cadena en esa secuencia o cerca de ella, fragmentando la molécula.
Tipos de enzimas
Tipo II
. Cortan en puntos específicos, generalmente dentro de la misma diana.
Tipo III
. Reconocen dos secuencias invertidas dentro de la misma cadena y cortan fuera de la diana de restricción, pero a una distancia corta (25-30 pb).
Tipo I
. Efectúa el corte en una región anterior o posterior de la diana a una distancia aleatoria de hasta 1000 pb.
Nomenclatura
. Se nombran normalmente con tres letras, la primera es la letra inicial del genero y las otras dos, las primeras letras de la especie.
Tipos de corte
Extremos rombos
. Se produce en el mismo punto en las dos cadenas, generalmente en el centro de la diana de restricción.
Extremos cohesivos
. Se produce en puntos distintos de ambas cadenas, normalmente en los extremos de la diana de restricción.
Aplicaciones en biología molecular
Permite crear moléculas de ADN recombinante
Procedimiento
Se cortan dos moléculas distintas de ADN con la misma enzima de restricción.
Cuando los fragmentos con extremos cohesivos de ambas moléculas se mezclan, se unirán por la complementariedad de bases de sus respectivas regiones monocatenarias generadas por la enzima de restricción.
Finalmente, las mellas que quedan en cada cadena se unen con una ligasa y se obtiene una molécula híbrida recombinante.
Patrones de restricción
Estos fragmentos se pueden separa según su tamaño mediante la técnica de electroforesis en gel, se obtiene un conjunto de bandas que es único para un ADN en particular y que se denomina patrón de restricción.
ADN polimerasas
Permite realizar copias de moléculas de ADN mediante replicación. De hecho, la técnica básica en biología molecular es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite obtener millones de copias de una secuencia de interés.
Otras enzimas
Son ADN polimerasas-AR dependientes. Es decir, sintetizan moléculas de ADN utilizando ARN como molde.
LIgasa
Unen dos moléculas de ADN mediante formación de enlaces fosfodiester entre los extremos 3' de una molécula y 5' de la otra.
Topoisomerasas
Relajan la tensión de la doble hélice de ADN próximas a las burbujas de replicación o transcripción.
Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt)
Es una ADN polimerasa que cataliza la incorporación de desoxinucleotidos al extremo 3' de una molécula de ADN. No requiere de un cebador ni de una cadena molde para ejercer su actividad. En presencia de una molécula bicatenaria de ADN y desoxinucleotidos, sintetiza colas de ADN monocatenarias en ambos extremos 3'.