Please enable JavaScript.

Coggle requires JavaScript to display documents.

Proteomics - Coggle Diagram

- - - - Groot eiwit omgezet in beter hanteerbare peptiden
    - - Knipt na R(arganine) en K(lysine): basische aminozuren
      - Er ontstaan positief geladen peptiden: MS compatible
- - - - Lage diffusie zorgt voor lage schotel hoogte
- - - - Analieten migreren zolang ze geladen zijn door een gel met een geïmmobiliseerd pH gradiënt.
      - Migratie stopt op isoelectrisch punt
    - - De gefocuste analieten worden zichtbaar gemaakt in de gel door staining
      - Voordeel gel: meerdere monsters kunnen naast elkaar gerund worden
      - Alleen voor biomoleculen
      - Na scheiding worden de eiwitten zichtbaar gemaakt, net als met een kleuring en de eiwitten worden geïdentificeerd aan de hand van een pI en een interne pH ladder die ook op de gel aanwezig is (bekende eiwitten met een bekende pI). Ook bij IEF kunnen meerdere monsters gelijktijdig worden gerund.
  - - - SDS-PAGE ; één van de meest gebruikte technieken voor de scheiding intacte eiwitten. Het kost een hoop werk. Is (bijna) niet te automatiseren. Relatief gevaarlijk (Acrylamide). De eiwitten worden gescheiden op grootte. Op de gel is ook een MW marker, een interne kalibratie aangebracht. De bandjes worden vergeleken met intensiteit en hoogte op de gel om eiwitten te identificeren. Gelelektroforese is een indirecte manier analieten als ionen te analyseren
      - Gel elektroforese is nogal een arbeidsintensieve aangelegenheid. Eerst moet het monster bereid worden, waarbij de eiwitten gedenatureerd worden. Daarna wordt 10 uL van het monster met een pipet in een monstervial in de gel (het slotje) gebracht.
        
        Daarna wordt een positieve spanning op de gel gezet en zoals in het plaatje te zien is, gaan de anionen van het slotje de gel in; de analieten moeten daarom ook negatief geladen zijn. De gel werkt als een zeef. De kleine moleculen kunnen makkelijk door de zeef heen migreren ver de gel in (laag op de gel heet dat). De grote eiwitten ondervinden meer hinder van de zeef en gaan moeilijker door de gel (komen hoger op de gel terecht).
    - - Een CE-SDS gel methode doet (bijna) dezelfde scheiding als SDS-page maar geautomatiseerd en veel gevoeliger.
      - De scheiding is op basis van grootte van het eiwit maar in eiwitten zijn grootte en gewicht sterk gecorreleerd.
        
        Vandaar dat er vaak gezegd wordt dat deze scheiding op basis van massa gebeurd.
      - SDS-Gel MW analysis met CE – groot bereik
        
        De scheiding op basis van grootte (massa) is heel voorspelbaar en de grootte (massa) van een molecuul kan ingeschat worden op basis van de migratie tijd.
        
        De scheiding is daarentegen niet lineair. De grafiek rechtsboven aan staat op een logaritmische schaal voor molecuul massa. Dit is gelijk aan size exclusion chromatografie
      - Optimalisatie
        
        Temperatuur
        
        % SDS
        
        Injectie
        
        Reductieproces
        
        Tijd
        
        Reagens
        
        Temperatuur
        
        Alkylatieproces
        
        Tijd
        
        Reagens
        
        Temperatuur
- - - - Groot eiwit omgezet in beter hanteerbare peptiden
    - - Knipt na R(arginine) en K(lysine): basische aminozuren
      - Er ontstaan positief geladen peptiden: MS compatible
  - - - Beste manier van identificatie
      - Voorkeursmethode: LC-MS/MS
        
        Hoge resolutieapparaat geeft betere identificatie
        
        OrbiTrap, Q-TOF
        
        Gecombineerd met databases zoals MASCOT
      - Vergeleken met referentie database
    - - Beste karakterisatie van een antilichaam
      - Meestal door vergelijking met
        
        Standaardantilichamen
        
        Database
      - Meestal niet alle peptide die ontstaan na digestie teruggevonden en/of geïdentificeerd in LC-MS/MS
- - - - Digestie altijd na denaturatie, reductie (S-S verbreken) en alkylatie (SH omzetten naar SR)