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環境分子生物技術概論 (ch6.1.Exchange of Genetic Materials (aka.水平基因傳遞)…
環境分子生物技術概論
ch6.1.Exchange of Genetic Materials
(aka.水平基因傳遞)
Cojugation
introduction to plasmid
F-plasmid
sex pilus
type IV secretion system
把複製的其中一半給對方
Transformation
competent cell
treatment
calcium chloride
electric shock
linear
success or not
plasmid
Transduction
by virus(噬菌體)
Lytic cycle
Lysogenic Cycle
general transduction
specialized transduction
ch6.2.Gene Cloning
(基因選殖)
Cloning的載體
plasmid
可自行複製、易純化
劃碟、選殖
藍白篩
LacZ
phage(aka.噬菌體)
做成含有限制酶辨識區間(restriction site)的序列，
包在噬菌體的capsid中
cosmid
plasmids + phages
artificial chromosome
只有序列非常大的時候才會用(150k~300k b.p.)
Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)
def.選擇性生成大量序列
TA Cloning Method
ch7.菌群結構
指紋譜分析
DGGE 變性梯度膠體電泳
(denaturing gradient gel electrophoresis)
PCR
Primer Design
GC Clamp
PCR中，各片段數量的成長
Separation
化學濃度梯度電泳槽
化學物種類
GC%, Tm值
Analysis
用亮度計量
因只能確定濃度區間，各band濃度無法確定，故分析時只有同一次電泳的序列才能比較，而如果真的要十分確定是否相同，就必須把band挖下來，拿去定序
TRFLP 端點限制性片段長度多態性
(terminal restriction fragment length polymorphism)
PCR
primer design
螢光分子
Separation
用限制酶切開
跑毛細管電泳
Analysis
可得知被切開的地方在序列中的位置，拿來對應data base，找出相近的物種
Microbial Community Structure
ch8.Gene Quantification
細菌難計量→計量特定DNA數量
計算一個細胞中有多少該序列的DNA
→推算細胞數量
方法
real-time PCR (qPCR)
Fluorescence reporting system
non-specific probe
SYBR-green
會結合所有雙股DNA
sequence-specific probe
Taqman Probe
分解才發亮
每個Cycle被分解的數量不同，設定亮度的threshold level，可得第幾個cycle測到光，即Cycle threshold(CT)。可用標準品的CT與log concentration求出校正曲線。
Hierarchical Oligonucleotide Primer Extension (HOPE)
設計不同位置的primer
螢光的ddNTP
理論上每個cycle環境中就會多出一次的螢光primer(線性成長)
濃度=起始濃度×Extension Efficiency×cycles
(Extension Efficiency對不同primer的值不同)
Digital PCR
ch5.微生物多樣性
與基因標記
演化計時器
(Evolutionary Chronometer;
Molecular chronometer)
定義
在高度保守的核酸或蛋白質中，突變率是固定的，透過計算Evolutionary Distance (Ed)，即兩物種間的差異量，可建構Phylogenetic Tree (系統發生樹)
條件(Carl Woose, 1987)
例子
SSU rRNA
Why SSU rRNA?
introduction to "Signature Sequences", "Probe/Primer", "Phylogenetic Tree"
Steps for SSU rRNA Analysis
ch9.Nucleic Acid Hybridization
hybridization
def.非primer的annealing
雜合超過70%→同種
probe hybridization
原位螢光雜合法
(Fluorescence in situ hybridization,FISH)
找出特定序列→設計螢光probe
發亮表示該細胞有該序列→計算細胞
steps for FISH
延伸
catalyzed reporter deposition fluorescent in situ hybridization，CARD-FISH
以酶作為發光元件
分子較大較難進入細胞，設計上偏難。但是亮度較高