Synthèse et Routage des protéines chez les eucaryotes

Problématique du routage

Cause compartimentation et polarité cellulaire : eucaryote 1000 à 10 000 x plus grosse que procaryote donc création organites imposant contraintes : échange, transfert prot et intégration dans la mb

Conséquences

RE

  • rugueux : trad des prot sécrétées et modif post trad (N-glycosylation et ponts SS), contrôle qualité
  • lisse : stockage calcium

Golgi : adressage des prot et modif (O-glycosylation)

Endosome : tout matériaux endocytés vont vers endosomes

Mitochondrie : synthèse AT¨P, respiration cellulaire.

Peroxysome : détox des cellules qui passent par H2O2

Lieu de synthèse protéique : lumen chloroplaste et mito, cyt (ADN nucléaire)

Mode de transfert des prot entre compartiments

En conformation débobinées passent dans canal, état maintenu avec association prot chaperon = HSP (stress thermique)

Transport co trad : transfert via canal en même temps que la synthese de la prot (dans mb ou lumen du RE)

Transport post trad

Transport via vésicules : de lipides, prot… -> bourgeonnement et fusion vésicule et mb de l'organite ciblé

Méthodes expérimentales pour analyse routage

Pulse chase :

  1. Radiomarquage du soufre de Met qu'on rajoute aux cultures de cellules = pulse
  2. Mise en contact 10à15min
  3. Elimination AA* pas incorporée = chase
  4. Mise en culture (il n'y a plus de AA*)
    -> toutes nouvelles prot seront radiomarquées

Méthode de fractionnement : centre pour récuperer indépendamment mito, RE...

Immunocytochimie : afin de localiser prot dans un organite, utilisation sonde couplée avec Ac associé à fluorochrome, billes métalliques ou enzyme

Génie génétique : prot fluorescente naturellement comme GFP (from méduse) -> fusion entre prot d'interet et ADN qui code GFP

Microscopie confocale : tranches de cellules de 400à500nm, on pourra analyser la fluorescence que dans une tranche et ensuite analyse dans ensemble des tranches assemblées pour analyse de la cellule entière -> permet de travailler dans organisme vivant. Limité à la fluorescence qui est la profondeur dans laquelle on peut exciter le fluorochrome. Il existe microscope biphotonique pour 2 fluorochromes

Synthèse et devenir des prot produites au niveau du cyt

Routage post trad : ARNm + ribosomes dans le cyt, prot à l'état débobinée. 4 destinations majeures selon séquence signale (si pas de séq alors restent dans cyt) : vers noyau (par pore nucléaire), chloro, mito (via transporteur), peroxysome (via transporteur). Transfert a besoin d'ATP ou GTP -> très rapide

Noyau

Nucléoplasme vers cyt : ARNr, ARNm, ARNt, facteurs de transcription

Cyt vers nucléoplasme : histone, ADNpol et ARNpol, ce qui est ncssaire à l'épissage, facteurs de transcription

Mise en évidence dans oeuf d'amphibien grâce à nucléoplasmine radiomarquée -> micoinjection, protéolyse et purification => pas de diffusion simple ou passive, il existe un moyen qui permet le passage dans noyau (pore) et des séquences en AA qui permettent le transfert

Séq NLS (Nuclear Localisation Signal) : si muté prot ne va pas dans le noyau. Séq reconnue par le pore nucléaire (2000à4000 sur la mb nucléaire). Pore constitué de la prot nucléoporine

Prot rétinoblastome (cyt->noyau) : régule cycle cellulaire, s'associe avec d'autres prot et se lie à des régions de l'ADN qui ne seront plus accessibles pour l'ADNpol -> prot suppresseur de cancer (rétinoblastome). Séquence NLS reconnu par prot adaptatrice importine-alpha (1e complexe) dans le cyt puis se fixe à un R libre, l'importine-beta (2nd complexe) qui va se fixer sur filaments cytoplasmiques bordant le pore, sur la séquence de la prot Nup358, ainsi complexe entre dans le pore, attiré par une autre séquence : FxFG située sur la protéine Nup153 qui apporte le complexe dans le nucléoplasme. Il y a ensuite dissociation du complexe par RanGTP

Remarque : il existe des protéines à localisation nucléaires ne nécessitant pas d’interaction à l’importine-α. De même RAN-GTP n’est pas toujours nécessaire au transfert de protéine via le pore. Il doit exister un système pour ramener les Importines du côte cytoplasmique.

Séquence NES (Nuclear Export Signal) riche en Leucine

Prot STAT1 : associée à exportine pour sortir du noyau, complexe va interagir avec Nup153 pour passer dans le pore. Dissocié ensuite par hydrolyse RanGTP en RanGDP

Régulation du trafic

Voie NFkB :

  • dans le cyt, liée avec IkB (inhibiteur kB) = OFF
  • IkB subit une ubiquitination : signal pour qu'il soit dégrédé afin que la séquence NLS soit visible pour transport dans noyau = ON

Voie NF-AT = Nuclear Factor of Activated T cells

Mitochondrie : En comparant les protéines présentes dans la matrice mitochondriale avec leur précurseur, on définit une séquence minimum de 12 AA localisé en Nt = séquence MTS avec AA qui vont former une hélice α amphiphile. Séq MTS reconnue par prot du complexe TOM ( = Transporteur Membranaire Exterieur, associé à chaperon dans cyt et dissocié une fois dans mito). Ce complexe va migrer sur mb externe de la mito pour trouver un endroit proche de la mb interne. Prot va passer par TIM23 ( Transporteur Membranaire Interieur) pour être dans la matrice -> il y a alors clivage de séq MTS donc la prot ne pourra pas aller dans d'autres mito. De l'NRJ est ncssaire, le passage de la mb externe à interne à la matrice se fait par force centripède grâce à un moteur moléculaire : HTP70 lié à ATP : se lie à des AA de la séq peptidique l'entraînant dans la matrice, ensuite hydrolyse ATP donc HTP se dissocie et se fait par d'autre HTP70

Peroxysome : pas de pore visible sur la mb. Prot a une séquence PTS1 et association avec PEX5 (prot de transport) -> formation complexe docking permettant l'entrée dans le peroxysome