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12_ snoRNA/ lncRNA 34 (Long non coding RNA (lncRNA) (Esempi di Link tra…

- - - - H/ACA
        
        quindi prende il nome dalla presenza di 2 particolari domini ed è caratterizzata dalla formazione di 2 loop a formare una struttura a “doppio dito”;
        
        è dato dalla presenza di due domini particolari, uno è Adenina-Citosina-Adenina nella porzione 3’ OH;
        
        E' coinvolta nella formazione di pseudo-uridine nel RNA target.
        
        l’altro è un box caratterizzato da una serie di Adenine inframezzate a qualsiasi nucleotide.
        
        Ha un cappuccio al 5’.
        
        Come avvengono la formazione di pseudo-uridine
        
        L'RNA guida nella formazione delle 2 dita forma 2 tasche che sono la porzione enzimatiche dello snoRNA di della classe H/ACA. Vengono contati 14-16 nucleotidi di binding e, al 17 nt, permette la localizzata dell’uridina che deve passare a pseudo uridina.
        
        Il tutto si basa sull’ibridazione del RNA guida con l’RNA da modificare
      - C/D
        
        Negli snoRNA di tipo C/D abbiamo la formazione di una struttura più lassa con appaiamento nella terminazione 3’ di 5 basi con una regione più in 5’.
        
        Questa non permette più la formazione di pseudo uridine da uridine ma permette la metilazione nella posizione 2’ del ribosio.
        
        Il nome C/D è dato
        
        dalla presenza di due box D (D’ e D a seconda della posizione) e due box C (C’ e C).
        
        La vicinanza dei box C/D permette l’interazione di una proteina deputata alla metilazione del ribosio (quello che ha la distanza di 5nt dal box D).
        
        Anche in questo caso la distanza del box permette la determinazione del sito di modificazione.
        
        La pseudo uridina è un’uridina che subisce una rotazione di 180° mentre la pseudo uridina si lega al carbonio 5 e va a ruotare di 180° la posizione attorno al carbonio 6.
        
        La metilazione del ribosio in posizione 2-O’ comporta l’aggiunta di un gruppo metilico.
        
        quindi Gli snRNA di classe Lsm e gli rRNA possono subire queste modifiche in modo ubiquitario perché gli snoRNA di classe H/ACA o C/D sono espressi in modo ubiquitario nelle cellule. La modificazione avviene per binding tra l’RNA target e l’RNA guida, quest’ultimo è caratterizzato da una struttura tridimensionale a 3 dita (H/ACA) o da una tasca più lassa dove però la distanza tra i domini C/D determina quale nt deve essere metilato in posizione 2' del ribosio
    - - questo vuol dire che le modifiche che vanno a portare sono ubiquitarie.
  - - - estremità negli introni canonici (GTAG) con un punto di ramificazione caratterizzato da un' adenina che permette l’attacco nucleofilo dell'estremità 5’ dell’introne a lasciare libero un 3’OH che può attaccare in modo nucleofilo l estremità 5’OH dell'esone successivo a liberare liberando un loop intonico e saldare i due esoni
      - In questi processi intervengono delle ribonucleoproteine caratterizzate dalla presenza degli RNA U: U4, U5, U6.
      - Mentre in introni che non sono canonici cioè non sono caratterizzati dalla presenza di una regione in 5’GU e in 3’ AG intervengono altre RNA: U4, U6 (houseSG), U11, U12.
      - Questi RNA piccoli U sono usati come geni di riferimento per le analisi in RT-PCR dei micro.
  - - - Gli snRNA di classe LSM sono quelli che vengono modificati dagli snoRNA di classe H/ACA.
        
        Sono caratterizzati dalla presenza:
        
        _ di un cappuccio di metilfosfoguanosina
        
        _ stelo al 3’
        
        _ sito LSM (dopo lo stelo al 3’) caratterizzato dalla presenza in uridina
    - - La classe SM degli snRNA è caratterizzata da:
      - un cappuccio di tri-metil-guanosina;
      - un sito ricco in A e in U
      - stelo o forcina in 3’ terminale
      - Un’altra differenza sta nel fatto che, la classe SM, è trascritta dal RNA pol2, mentre gli LSM sono trascritti dal RNA pol3.
  - - - hanno delle dimensioni compatibili con i pre miRNA
- - - - sono + lunghi 200nt
    - - basati su colonnine di idrossiapatite
      - si basano sulla capacità di legame degli RNA sull'idrossiapatite in funzione del concentrazione di etanolo
        
        < è la concentrazione di etanolo > sarà l'attività degli RNA lunghi legarsi alle colonnine
        
        > è la concertazione di etanolo > sarà l'attività degli RNA corti a legarsi alle colonnine
      - se volete separare long da short
        
        estrazione fenolo clrofornio
        
        Perciò, se prendete la fase acquosa e aggiungerci in genere il 60% di etanolo assoluto fare passare attraverso la colonnina la soluzione, passeranno gli RNA corti mentre verranno trattenuti gli RNA lunghi
        
        si mette da parte questa colonnina se ne prende una nuova si aggiunge etanolo all'eluato ( quindi la concentrazione di etanolo>) si fa passare su questa nuova colonnina l'eluato con la con di etanolo > che contiene gli RNA corti visto che quelli lunghi sono legati alla prima colonnina. alla seconda colonnina si legheranno gli RNA corti (200pb)
        
        l'eluato viene gettano
        
        abbiamo 2 colonnine si fanno i lavaggi e si eluisce
        
        è si ottengono 2 tubini contenenti : RNA lunghi e RNAshort
  - - - possono essere
        
        anti-senso rispetto ad un altro RNA lungo codificante o non codificante
        
        possono stare nella porzione intronica di geni codificati
    - - Dovete avere un modo per costruire una libreria in cui, l’adattatore A si lega sempre in 5’ e l’adattatore B sempre in 3’; così facendo avrete un modo per discriminare gli RNA senso dagli antisenso, non posso invertirli perché so dove stanno gli adattatori
    - - in genere sono trascritti in direzione opposta a quella del gene codificante
      - possono essere B direzionali
        
        cioè alla direzione di trascrizione di un gene codificante nella direzione opposta senza sovrapposizione con il gene codificante
  - - - se lncRNA viene attivato assume una struttura 3D che mima la struttura alla quale il fattore di trascrizione (glucocorticoide receptor) si associa al DNA
      - quindi il fattore di trascrizione si assogia a Gas5 e non può più associarsi al sito di legame sul DNA
      - presenta un sito di legame per fattore di trascrizione
        
        Glucocorticoide receptor regola un sacco di geni coinvolti nella crescita
      - di riflesso i geni regolati da questo FT non vengono più trascritti (depriva la cellula da quella prot )
    - - è un lncRNA INTERAGISCE sia con un complesso poly-comb che a LSD1-CoREST (complesso de-metilazione degli istoni).
      - in modo tale da produrre la formazione di metilazione nella Lisina 27 del istone o demetilazione della lisina 4 dell'istone H3
        
        produce silenziatore genico
      - quindi l'espressione regola l'espressione genica con 2 meccanismi diversi
        
        fa da scaffold di modo tale da portare negli stessi siti PRC2 e LSD1 , in modo tale da alterare la metilazione dell'istone H3 sulla regione cromosomica e quindi andarla a silenziare
    - - avviene tramite i complessi poly-comb che richiamano le metilasi nel sito d-interesse.
    - - Se ho un RNA lungo e voglio silenziare solo una certa regione e non un altra, come faccio a portare le proteine che vanno a metilare l’istone in posizione 27 e non in un altra ?
    - - come fa a formarsi?
    - - sono degli RNA trascritti da regioni ehnancer del genoma e sono caratterizzati dalla struttura cromatinica particolare, metilazione e acetilazione degli istoni sono specifici delle regioni di enancing del genoma e danno vita a lncRNA particolari che sono E-Rna
  - - - Per definire un lncRNA ci sono 2 caratteristiche fondamentali:
        
        più lungo di 200bp
        
        2_ Durante la ricerca di OpensRidingFraime, nella sequenza del lncRNA non dovete trovare capacità di sintesi peptidica di peptidi al di > 10 aa
        
        Si è visto che qualche lncRNA può codificare per peptidi piccolissimi, ci sono lavori che evidenziano che qualcuno dei micro peptidi ha delle funzioni.
      - Analizzando questo RNA hanno visto che non ha capacità codificanti,
    - - si sono accorti che, quando il lncRNA veniva trascritto, il quantitativo di proteina derivante dal trascritto di UchL1 aumentava.
    - - Sono poche le proteine alterate senza alterazione anche del messaggero
    - - L’antisenso di UchL1 il quantitativo di proteina aumentava.
      - quindi hanno detto, abbiamo un antisenso rispetto UchL1 abbiamo un messaggero che non cambia, però questo UchL1 antisenso è in grado di attivare la traduzione di quel messggeo che non cambia
        
        Quindi si è cercato di capire meglio come funzionasse l’antisenso (AS UChl1);
        
        E hanno cercato di caratterizzarlo prima da un punto di vista bioinformatico e quindi hanno preso la sequenza dell'antisenso e cercato di capire che tipi di domini era caratterizzato.
        
        Hanno visto, Struttura:
        
        Ø un dominio SINE B2 (un retrotrasposone)
        
        Ø una sequenza Alu
        
        Ø regione di omologia con Uchl1 di pochissimi nucleotidi (70) che si poteva ibridare con il trascritto di Uchl1.
      - Per questo motivo alla fine il lncRNA è stato chiamato SINEup perché ha un dominio SINE e up-regolano il quantitativo di proteina (codificata dal trascritto che viene intercettato da questi lncRNA).
      - Hanno creato
        
        Un trascritto con un dominio SINE B1, che avesse la capacità di targhettare qualsiasi trascritto per il quale volessimo aumentare il quantitativo di proteina.
      - Hanno creato l’applicazione biotecnologica creando un RNA che non codificasse per proteine,
        
        ma se vogliamo up regolare qualsiasi proteina in una determinata cellula dobbiamo prendere
        
        Un trascritto in grado di targhettare per un breve tratto (40-50nt) il trascritto che codifica la proteina nel 5' e che questo avesse ad una certa distanza le regione SINE.
      - La funzione del lncRNA è data ancora una volta dall’ibridazione ad un target particolare;
        
        E solo il binding domain dà la specificità di targeting del lncRNA con il messaggero d’interesse. Tutto il resto del lncRNA è la parte effettrice, questa permette di aumentare la traduzione di un messaggero il quale non varia la concentrazione (non c’è più messaggero quando la cellula sintetizza più proteina).
        
        A questo punto hanno creato una serie di costrutti, che fossero :
        
        deleti per la sequenza Alu (Alu con la X sopra) ma che avessero la sequenza SINE (∆A)
        
        deleti per la sequenza SINE (SINE con X sopra) ma con la sequenza Alu (∆S)
        
        deleti per entrambi (∆AS)
        
        con la sequenza SINE messa nella direzione diversa e sequenza Alu (Sf) con la sequenza Alu invertita di posizione rispetto alla SINE (ASf)
        
        Sono stati fatti una serie di clonaggi per permettere la sintesi dei trascritti modificati.
        
        È stato fatto un western tra UCHL1 e i trascritti sintetizzati dalle cellule.
        
        Allora le cellule sono state trasfettate con senza antisenso di Uchl1
        
        La beta-actina funge da normalizzatore (sarà uguale per tutti i saggi). FL: è il full-lenght dell’antisenso di UchL1, questo ha un quantitativo di proteina molto maggiore rispetto alla trasfezione delle cellule senza antisenso di UchL1.
        
        Se voi trasfettate le cellule con
        
        ∆A: l’antisenso (∆A) di UchL1 che ha la delezione di Alu, in questo caso avete ancora un aumento della sintesi della proteina (rispetto a quando l’antisenso non è presente),
        
        questo vuol dire che
        
        quindi Alu è dispensabile dal trascritto,c'è ma non è essenziale per esplicare la funzione di up regolare la prot
        
        Se trasfettiamo le cellule con
        
        ∆S: è l’antisenso di UchL1 senza la sequenza SINE, in questo caso osserviamo una riduzione della sintesi della proteina
        
        È quindi la sequenza SINE B2 responsabile dell’aumento della quantità della proteina.
        
        Trasfettando le cellule con l’antisenso Uchl1, costrutto per il quale è stato deleto (∆AS) Alu e SINEB2 rimane il bainding domain, la sintesi della proteina è paragonabile a quella che si aveva con ∆A e all’assenza dell’antisenso di UchL1
        
        Riassumendo:
        
        Dovete avere le sequenze SINEB2 all’interno dell’antisenso, queste devono stare in una certa direzione rispetto al trascritto, la sequenza Alu non è importante può essere eliminata o può essere anche spostata rispetto alla SINE.
        
        Nelle HEK293 non c’è un aumento di proteina così considerevole come nelle MN9D, ciò fa pensare che l’applicazione biotecnologica vada modellata a seconda del tipo di cellule da modificare (secondo il quantitativo di proteina normalmente prodotta nelle cellule: UchL1 in MN9D viene già sintetizzata in quantitativi elevati quindi la cellula risponde bene; in HEK293 viene sintetizzata in quantitativi più bassi quindi anche la risposta è più blanda quando si utilizza l’antisenso)
        
        la regione di similarità con UchL1 era stata identificata in una regione di 70 pb si ibrida nel sito di inizio della traduzione di UchL1 e si ibrida con una regione che va dall’ATG fino a 40 nt in 5’ e dall' ATG fino a 32 nt quindi dentro dentro la regione di traduzione di UchL1
    - - e quello che si è visto è che nel processo di attivazione della traduzione deve essere presente una SINE B2
        
        ed è fondamenta la presenza per permettere traduzione di UCHL1
        
        altra cosa fondamentale è lapresenza di un buinding domain per l'rna che codfica per UCHL1
      - lncRNA ha 2 domini importanti uno di omologia per l'mRNA di UCHL1 e una SINE B1 all'interno della sua sequenza
    - - UchL1 è il gene codificante ed è trascritto in un verso UchL1 antisenso è il LncRNA ed è trascritto nel verso opposto
      - Antisenso ha la presenza di una SINE B2 + seq. ALU+ è presente una sequenza di omologia UChL1
    - - la proteina sintetizzata da UchL1 > quando c'era una sovra-espressione dell'antisenso di UchL1
      - ci aspettiamo che RNAmesagero salga dato che la proteina >
        
        Fatta la RT il messaggero non variava
      - quindi hanno preso la sequenza anti-senso di UchL1 e hanno iniziato a tagliare
        
        per determinare se era presente una minima sequenza di Uchl1 antisenso che permetteva l'up regolazione della proteina stessa
        
        hanno identificato la regione
        
        questa sequenza conteneva le SINE B2 + Alu
      - quando avete il full ent dell'antisenso di UchL1 vedete che la proteina >
        
        quando hanno deleto la sequenza Alu la proteina continuava ad essere >, quindi non serviva a niente
        
        quando hanno deleto SINE B2 la proteina non > più, questo ha permesso di comprendere che questo trascritto antisenso ad UchL1 non va ad > la sintesi del RNA ma della proteina
        
        quindi è di fondamentale importanza la presenza delle SINE in antisenso
  - - - e sono trascritti dalle RNAPol2
  - - - es_ lncRNA che basa la funzione sulla struttura secondaria sono gli small nuclear RNA:
        
        CD
        
        Esistono 2 coppia di box C e D
        
        e una a metà della sequenza
        
        Una alle estremità in 5' e 3'
        
        struttura circolare con un appaiamento terminale in modo tale da permettere questa circolarizzazione
        
        La struttura circolare caratterizzati da box C e D che svolgono funzioni di questo gruppo di RNA negli eucarioti
        
        caratterizzata da una struttura single strend
        
        bolla dove permette 'appaiamento del RNA targhet.
        
        La proteina non sa dove metilare,
        
        adopera un RNA guida che grazie all'appaiamento del RNA targhet posiziona il sito che quella proteina deve modificare
        
        Questo appaiamento fa sì che una determinata base si venga a posizionare vicino al box D perchè esso identifica il sito da metilare in posizione 2' del ribosio.
        
        queste basi saranno vicine alla proteina che permette la metilazione
        
        Quindi la cooperazione della struttura 3D che permette l'appaiamento del RNA targhet e anche il posizionamento delle proteine effettrici fa sì che solo quella posizione del ribosio venga metilata
        
        HACA
        
        è una struttura a 2 dita, con un box H intermedio alle due dita e un box ACA in estremità 3'.
        
        Caratterizzati da una Struttura digiti-forme, nella fattispecie formano 2 anse
        
        le 2 anse sono appaiate per una certa lunghezza, formano
        
        una bolla interna e dopo di che continuano ad appaiarsi
        
        e formano una bolla terminale (necessaria per il ripiegamento ) .
        
        la bolla interna è importante per il funzionamento
        
        mentre la struttura A-B ansa è fondamentale per l'interazione con le proteine che devono operare insieme a questi small NucRNA
        
        Funzione di questo Rna
        
        la prot che opera l'azione non riconosce la sequenza è lo smallNuc RNA che fa da guida,
        
        Interagire con le proteine effettrici e
        
        con il targhet sul quale le prot effettrici dovranno andare ad operare
        
        Porta nella posizione corretta l Uridina che deve essere modificata dalla proteina che è nelle vicinanze di quella posizione.
        
        Quindi RNA targhet si ibrida a questo smallNucRNA, nella bolla del dito. Ci sono 2 bolle xchè ci sono 2 dita....
        
        La capacità di funzionamento di questi Rna è di modificare l' RNA .. COME?
        
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      - lncRNA che sono coinvolti nello SPL
        
        es_ U1 ha una struttura terziaria che riconosce la giunzione esone introne per permettere il posizionamento di specifiche proteine coinvolte nello SPL
    - - small RNA (micro e smallNucl RNApermettono la modificazione chimica di alcuni RNA)
  - - - Interazione tra una proteina e il LnRNA
        
        Gas6 long che si attiva durante le fasi di deprivazione del cibo
    - - tramite l' interazione della loro sequenza con la sequenza di DNA
      - se loro sono in grado di legare delle proteine e a loro volta sono in grado di legare una regione di DNA
        
        sono per transizione in grado di portare quelle proteine in quella regione di DNA e quindi sono in grado di permettere a quelle prot di svolgere la loro funzione in quella regione e perciò non sono le prot che devono cercare la regione di interesse ma è lncRNA che fa da tramite per la ricerca della regione fuinzionale sulla quale le prot svolgono la loro funzione
    - - può intervenire un lncRNA che mima un sito di interazione, che se porta con se la prot necessaria per la funzione di quest'altra proteina completa l'azione biologica
    - - questo meccanismo è portato a termine grazie all'intervento dei lncRNA intervengono in 2 modi :
        
        interagire con le proteine che legano il DNA sul promotore ( quindi quei fattori di trascrizione che attivano la trascrizione di quel gene)
        
        e utilizzare parte della sequenza del lncRNA per andare a ricercare per omologia di sequenza la regione di enancing che magari può essere ricontattata da queste proteine in modo tale da > l'attività trascrizionale del gene di interesse
      - ipotesi della presenza di una sequenza molto distante nel genoma rispetto al promotore che permettesse l'> della trascrizione
    - - (gli pseudo-geni sono degli RNA lunghi, abbiamo visto che sono in grado di regolare la traduzione delle proteine).
    - - pbt1 e che è trascritto in direzione opposta a SIBIK è in grado di regolare la concentrazione di Sibik (è un fattore di trascrizione che regola la proliferazione cellulare e . Ha un sito di fosforillazione, quando questo viene fosforillato esso viene degradato.
      - PbT1 è un lncRNA mima la struttura di questo sito di fosforillazione, la blocca e permette a sibik di essere mantenuto come tale e quindi di funzionare