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Principales méthodes d'études (Amplification AN in vitro…
Principales méthodes d'études
Amplification AN in vitro
Amplification PCR
PCR en point final
: photocopie massive,
qualitative
PCR en temps réel
: suivie cycle après cycle, quantitative
Quantification relative : comparaison à une référence
Quantification absolue: déterminer à la copie près le nombre de molécules de départ
Etapes
Dénaturation par la chaleur
: obtention de 2 ADN simple brin
ADN polymérase thermostable
: obtention de 2 molécules identiques à la molécule de départ
Hybridation des amorces
: oligonucléotide de synthèse, chaque brin a une amorce
Rendement théorique
: 30 cycles = un milliard de copies, multiplication par 2
Rendement réel
: 80/85% donc multiplication par 1.85
RT- PCR
Amplification molécule d'ARN
Etapes
Reverse transcriptase = RT, obtention d'un ADNc
Mêmes étapes que la PCR
PCR / RT-PCR quantitative
Savoir que je suis infecté mais trouver le nombre de bactéries présentes
Amplification du génome de la bactérie
Peu d'amplification = pas beaucoup de bactéries
Beaucoup d'amplification = beaucoup de bactéries
PCR digitale
Amplification individuelle de chaque fragment + observation de façon séparée
Possibilité d'observation l'ADN muté même si minorité
Test
quantitatif
et hautement
sensible
Hybridation moléculaire
Éléments nécessaires
Sonde
Séquence nucléotidique
d'au moins 20 nt
homologues à une séquence ADN ou ARN
Exemples
ADNc (copie ARNm)
Oligonucléotides de synthèse
Marquage
Nécessite mise en évidence, un des deux éléments (cible ou sonde) du complexe doit porter un marquage
Différentes hybridations
Hybridation in situ
FISH ou Multi FISH
Hybridation sur membrane
Etapes
Fragmentation ADN avec enzyme de restriction
Séparation selon taille par électrophorèse
Transfert des fragments sur membrane de Nylon
Ajout d'une sonde pour marquer que les fragments qui nous intéressent
Principales techniques
Southern Blot
Hybridation sonde ADN / ADN cible
Northern-Blot
Hybridation sonde ADN / ARN cible
Western-Blot
Hybridation protéines / anti-corps
Hybridation dans un tube
Séquençage haut débit, microbiologie
Puces à ADN
1cm2 = 6 500 000 sondes
Sondes directement sur la puce, ajout de la cible après
Applications
Profil d'expression des gènes
Détection mutations, polymorphismes
Détection d'anomalies chromosomiques (Array-CGH)
Séquençage
Méthode de Sanger
Séquençage NGS : haut débit
Etapes
Fabrication d'une banque :
fragmentation ADN (enzyme ou sonication) puis ajout de 2 adaptateurs sur chaque fragment (oligonucléotides de synthèse)
Amplification clonale
: chaque segment amplifié individuellement et séquencé individuellement
Utilisation de
bare code
: reconnaissance du patient (6-8nt)