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4 SONDE (AMPLIFOUR (2_ Si deve avere una sonda per ciascun gene (Quindi è…

- - - - 1_ Ibridazione del primer
      - 4_ Il primer riesce a leggere all'interno di questa forcina
        
        Perchè si stacca la struttura a forcina della sonda e
        
        Amplifica fino al termine della sonda
        
        In questo caso la sonda sarà estesa
        
        Si avrà una fluorescenza direttamente proporzionale al quantitativo di filamento complementare che viene sintetizzato.
      - 2_ Amplificazione
      - 3_ Primer revers, Amplificazione
  - - - ES: se devo testare 4 geni mi conviene avere dei primer senza sonde e averne uno universale che posso utilizzare per tutte le analisi
  - - - Una Regione Specifica per il gene al 3'
      - Una Regione nel loro 5'(coda) = Sequenza Universale
        
        Alla quale si andrà ad ibridare la nostra unica sonda che è disegnata per tutti i saggi che si vogliono fare
    - - Perché la specificità dei vari geni è data dal primer Z nella sua regione specifica di amplificazione.
    - - FASI
        
        1° Ciclo la mix di PCR
        
        lo fate con
        
        con i Primer Z più le sonde
        
        Primer Z sono quantità limitante
        
        Andranno ad ibridarsi al target per essere utilizzati nei primi due/tre ciclo
        
        Gli Ampliconi prodotti nelle fasi iniziali avranno all’estremità la porzione Z.
        
        Nei cicli successivi al 3°
        
        Sarà la sonda che si ibrida alla regione Z
        
        Quindi la Pol allungherà la sonda e avremo la fluorescenza.
        
        La lettura si farà al termine della fase di estensione, quando la sonda è strecciata
  - - - Questa viene inserita sul nostro gene di interesse utilizzando dei primer particolari: i primer Z,
- - - - Quando facciamo l’Annealing,
        
        Il loop si andrà ad ibridare sul target
        
        La sonda subisce streccia (si allunga),
        
        La struttura a loop si apre e fluoroforo e quencher non sono più vicini (non si ha più FRET)
      - ASPETTI
        
        Miglior metodo per l’analisi di SNP,
        
        Costano
        
        Bisogna disegnare delle sonde che sono specifiche per il gene e ogni sonda è diversa per gene diverso
      - La sonda e quindi
        
        Il Loop
        
        E la parte variabile
        
        E' la parte della mB che permette l'ibridare con il targhet
        
        e 2 braccia
        
        La parte costante sono le 2 braccia
        
        Si ibridano tra di loro e permettono la formazione di una struttura a forcina
        
        Presenta un fluoroforo 3' ad un estremità ed un quencer 5' all'altra
      - Funzionamento
        
        Quando la sonda è ripiegata
        
        Non può emettere fluorescenza visibile dalla macchina
        
        I 2 gruppi (FeQ) sono vicini
        
        Quando la sonda si lega ad un filamento del DNA amplificato
        
        Si perde la conformazione a forcina ed il fluoroforo risulta attivato in quanto non più adiacente al quencer
        
        Poichè il rilevamento della fluorescenza dipendente dalla stabilità relativa della forcina e dal legame al bersaglio, il metodo risulta più specifico (risp Taq)
      - La LETTURA
        
        Avverrà perchè
        
        fluoroforo e quencher stanno distanti (annelling)
        
        Denaturazione
        
        Questa però non sarebbe proporzionale alla quantità di templato MA è data dal quantitativo di sonda che si mette
        
        A 95°C 30sec
        
        Si dissocia tutto/ apertura della struttura 3D della sonda
        
        Si ha la lettura della fluorescenza,
        
        Annelling 60°C 20sec
        
        Avviene l’ibridazione sia dei primer sia della sonda
        
        Qui viene letta la fluorescenza
        
        Extention 1min
        
        La sonda si dissocia dal targhet
        
        la Fluorescenza è direttamente proporzionare alla Quantità di sonda ibridata che è direttamente proporzionale alla quantità di target sintetizzato
      - Hanno un F e Q ma NON sono un frammento lineare ma sn costruite in modo da avere:
  - - - FASI
        
        3_ Estensione (72°)
        
        La DNAPol si lega al 3' del primer ed inizia a polimerizzare la sequenza complementare
        
        Abbiamo la Formazione del filamento neo sintetizzato
        
        4_ Denaturazione 95°
        
        Avviene la Dissociazione
        
        Separazione del filamento stampo e del neo sintetizzato
        
        Se leggo la fluo in fase di dissociazione
        
        Leggiamo la fluorescenza data dal Q
        
        Non ho la lettura proporzionale al quantitativo di templato neo sintetizzato
        
        5_ 55° Raffreddamento
        
        Non alla temperatura di Annealing del primer, MA a quella del Primer che fa da sonda,
        
        E si avrà :
        
        Un’apertura
        
        porterà ad avere una fluorescenza se ho templato sintetizzato
        
        Chiusura della molecular Scorpion
        
        e quindi non avrò fluorescenza in assenza di templato sintetizzato
        
        1_ DENATURAZIONE (95°)
        
        La sequenza di DNA (complementare alla sonda), viene resa a singolo filamento
        
        2_ Raffreddamento (55°)
        
        la molecola hairpin si lega al filamento complementare sul templato
        
        Funziona da innesco per Pol
    - - 1_ I Ripiegamento è intra-molecolari
        
        Sono favoriti da un punto di vista cinetico
        
        L'ibridazione Inter Molecolare = più sfavorita perchè richiede energia rispetto a quella intra molecolare
      - 2_ Utilizzo la Taq polimerasi, .
        
        Quindi uso della Taq a 72°C
        
        Visto che c'è un Ri-arrangiamento non c'è la necessità di degradare la sonda
      - 3_ Il rapporto
        
        Abbiamo un rapporto di fluorescenza di una molecole un targhet di 1:1
      - 4_ il Blocker
        
        Serve ad impedire che la DNApol polimerizzi oltre il blocher;
        
        Questo porterebbe alla separazione del Q e F causando una fluorescenza aspecifica.
      - 5_ LETTURA
        
        Prima di Ri partire con il Secondo ciclo di Anniling
        
        Fate un Anniling specifico per la sonda
        
        Quindi avrà una temperatura di Melting detta dal rivenditore
        
        Al secondo ciclo fate la lettura nella fase di ibridazione della sonda con il suo targhet a es_ 68°C e a quel punto leggete = si riparte
      - Scorpions Bi Probe
        
        Sono costruite come sonda scorpion
        
        dove la sequenza del loop viene mascherata da una sequenza complementare
        
        La lettura
        
        Dopo il culing leggiamo la fluo solo delle molecole appaiate in modo intramolecolare.
        
        Perchè quelle che non hanno trovato una complementarietà intra molecolare si ri-appaieranno alla molecola che scherma che porta il Q,
        
        Quelle che non hanno trovato appaiamento intra molecolare si richiuderanno nel caso del scorpions BiProb e Monoprob rispettivamente
        
        Funzionano come i mono probe ( un probe con F e Q vicino)
        
        la differenza
        
        Non è una sequenza diversa dalla seq usata pre ibridazione intramolecorare per produrre l'appaiamento
        
        ma è la stessa sequenza che viene usata per appaiamento intramolecolare ad essere utilizzata per produrre un oligo che va ad appaiare e questo porta il quencer.
        
        In modo tale che
        
        quando è appaiato alla sequenza che riconosce la regione intramolecolare ci sarà il quencing del fluo
        
        quando invece va in soluzione (separato ) la sequenza che veniva schermata dalla seq dell oligo sarà libera di andare ad intercettare la regione intramolecolare
        
        e quindi a produrre quel riarrangiamento strutturale di modo tale da permettere la lettura perchè il quencer non è più vicino al fluoroforo
        
        (sono più efficineti dal punto di vista fluorescenza)
        
        Una tipologia data dall’ibridazione di due primer complementari, questo fa si che il Q vada a finire in una posizione molto più distante rispetto a quanto avviene con il singolo riarrangiamento.
    - - 1) Data dalla formazione di una struttura 3D con il loop
      - 2) Data dall’ibridazione di 2 primer complementari
        
        Questo fa si che il Q vada a finire in una posizione molto più distante rispetto a quanto avviene con il singolo Riarrangiamento
      - 3) Amplifuor
    - - Gli elementi di base sono
        
        1_ Il primer specifico di amplificazione per il gene di interesse al quale è associato un
        
        2_ Bloccher impedisce alla polimerasi di estendere il primer per PCR.
        
        3_ Più la Sonda a catena singola
        
        Ha 2 sequenze all'estremità della sonda
        
        Che sono complementari tra loro e quindi ne permettono la chiusura e ripiegamento e
        
        Un loop
        
        Dà la specificità di ibridazione con il targhet
      - Una molecola contenente: un primer (3') e da un probe(5') bi-etichettata a catena singola tenuta in una conformazione a forcina
      - Funziona anche questa per FRET
  - - - Basata sulla FRET
        
        Usata per permettere l'emissione della fluorescenza letta dallo strumento
      - Come funzione
        
        Lo strumento legge la fluorescenza emessa dal fluoroforo accettore (Q) e non dal donatore(R).
        
        La lettura avviene solo quando accettore e donatore stanno VICINI
      - Come sono disegnate le sonde ?
        
        Sono due sonde, quindi si ha una specificità un po’più elevata
        
        Hanno nel donatore al suo 3' il fluoroforo nel caso dell accettore al suo 5' il fluoroforo e al 3'P
        
        Quindi per evitare questo la sonda accettore
        
        Ha al 3’ un fosfato (P)
        
        A cosa servono queste disposizione?
        
        A mettere testa a testa vicini fluoroforo Donatore con fluoroforo accettore
        
        Impedire che la sonda accettore funzioni, per la presenza del gruppo fosfato in 3’= da primer d’innesco per la Dna polimerasi.
        
        L'oligonucleotide è disegnato con
        
        Il DNA ha normalmente 5'P e 3'OH
        
        La presenza del 3'OH libero crea un attacco alla DNAPol e polimerizza
      - ASPETTI
        
        Non potete fare saggi di multiplexaggio
        
        Perché avete la necessità di avere delle sonde con fluorofori multipli.
        
        La sonda deve essere progettata accuratamente / ogni targhet richiede una sonda specifica / Costo elevato
        
        L'attività esonucleasica non è necessaria in questo saggio
        
        Quindi le sonde possono essere utilizzate via via nei cicli successivi,
        
        Perchè le sonde non vengono degradate
        
        Permette l’analisi di SNEP,
        
        Sono specifiche
        
        Per il fatto di essere delle sonde, hanno anche questi tipi di saggi un elevata specificità
      - Più i cicli di PCR vanno avanti + avete il ds che si va a generare e più sonde si ibridano
        
        Quando invece avviene l’ibridazione, quindi l’annilling
        
        In questo caso non è necessario avere un attività Esonucleasica
        
        Perché basta la capacità di scalzare da parte della DNAPol delle due sonde, per permettere avanzamento della polimerizzazione
        
        > via via l'intensità di fluorescenza quando il donatore viene eccitato
        
        La sonda accettore e donatore stanno vicini = Fret
        
        Se facciamo la lettura in fase di Estensione
        
        La TAC arriva alla sonda e la scalza separando il fluoroforo A e D = non abbiamo lettura nel rosso xche emettete solo nel verde
        
        Quindi quando le sonde sono in soluzione,
        
        IL fluoroforo donatore e fluoroforo accettore sono DISTANTI
        
        Illumino il pozzetto con una lunghezza d’onda tale che mi permetta di avere un emissione di luce dal fluoroforo Donatore,
        
        Il Fluoroforo Accetore NON Riceve l’energia emessa dal donatore e ho un emissione di verde
        
        la macchina non mi legge il verde ho la mia fluorescenza ma non la legge
      - Roche ditta
    - - Caratteristiche
        
        E' un unica sonda Oligonucleotidica
        
        E' marcata
        
        5' con un fluoroforo ad alta energia (reporter)
        
        al 3' un inibitore del fluoroforo (quencher).
        
        E' basata sulla FRET
        
        Es_ Gruppo fluorescente che è quello che la macchina legge, se il Q è vicino al GF.
        
        La macchina eccita GF questo emette la sua lunghezza di fluo che però viene assorbita dal Q
        
        Q emette una fluo diversa da quella del gruppo fluorescente
        
        Con un Agente Spaziatore
        
        Tra GF e Q
        
        Quella parte di sonda Complementare ad una sequenza interna di uno dei 2 filamenti amplificati
        
        Lunghezza tale da permettere la FRET
        
        Come Avviene ?
        
        se Q e GF
        
        sono Lontani
        
        sono Vicini
        
        F viene eccitato ed emette ad una lunghezza d'onda
        
        Il Q assorbe la fluo ed emette ad una lunghezza diversa
        
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        Ho la fluorescenza e l'emissione della fluorescenza = lettura
        
        Quando la sonda è in soluzione è in struttura lineare, anche quando è ibridata è in struttura lineare
        
        Quindi quando F e Q stanno vicini = abbiamo FRET (non leggiamo la fluo)
        
        Quando invece abbiamo un processo di amplificazione abbiamo = fluorescenza
        
        Permette di capire quanto amplicone viene generato nel tempo = intensità di fluorescenza
        
        Intensità di fluorescenza
        
        Emessa rappresenta una misura direttamente proporzionale alla quantità di prodotto formato
        
        Cresce ciclo per ciclo perchè,
        
        Con questi saggi è necessario avere
        
        Una TaqPol con attività Esonucleasica 5' 3'
        
        Che cosa fa?
        
        1_ Quando denaturo il mio DNA avrò il mio primer e sonda in soluzione = 0 fluo
        
        2_ Quando arrivo a 60°C ho ibridazione sia della sonda che del primer = non ho ancora fluo
        
        3_ Parte la PCR
        
        Alla fine dell'amplificazione leggo la fluo data dal R che si è staccato dal Q
        
        La DNA Pol inizia a polimerizzare, quando arriva a contatto con la sonda iridata, la degrada = Q e F vanno in soluzione
        
        Questa fluo è direttamente proporzionale alla quantità di sonda che viene degradata
        
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        Quindi Uso una DNAPol particolare che mantenga l'attività Esonucleasica (permette la degradazione della sonda)
        
        Per degradare la sonda e permettere la fluorescenza
        
        E' un compromesso tra la capacità della DNApol di degradare la sonda e la sua capacità di polimerizzare
        
        questo vuol dire che non si possono utilizzare con attività della Pol a 75°
        
        In genere i cicli sono 95- 60°(Tm) o in alternativa 95 60 75 che è la t estensione mentre 60° è la Tm
        
        Quest'ultimo ciclo con le sonde Taq non può essere utilizzato
        
        Esonucleasica è bassa alla temeratura di 75 quindi si lavoroa in condizioni sub ottimali per l attività della Polimerasi
        
        perchè l'enzima che viene utilizzato è ottimizzato per funzionare sia con attività polimerasica che esonucleasica
        
        Acquisto delle sonde che siano F e Q compatibili con i filtri installati nello strumento ( datacip dello strumento). Lo strumento deve leggere i GF delle sonde.
        
        Su cosa si basa il saggio ?
        
        L'oligo che riporta F e Q, si ibridano sulla sequenza d'interesse generata dalla coppia di Primer
        
        La coppia di primer deve stare in 5' e in 3' nella regione contenente la porzione di DNA alla quale la sonda si va ad ibridare
      - ASPETTI
        
        VANTAGGI
        
        Elevata specificità dei primer
        
        Possibilità di multiplexar
        
        La possibilità di analizzare gli SNP
        
        SVANTAGGI
        
        La sonda deve essere progettata accuratamente
        
        Ogni targhet richiede una sonda specifica
        
        Costo elevato
        
        Impossibile analizzare al fluo generata dalla curva di Melting (data dalla dissociazione/ ri-associazione dei templati dice se abbiamo apliconi grandi o piccoli )
        
        xchè in questo caso la fluo viene data dalla degradazione della sonda
        
        Coppia di primer specifici
      - PlayBayoSystem
      - La LETTURA
        
        Alla fine dell'estensione
        
        Perchè in fase di annelling = non leggiamo fluo xche sonda integra
        
        Avete inizio della polimerizzazione se la sonda è disegnata come sequenza di RNA avete che l'attività esonucleasica della DNAPol degrada quell unica sonda legata al cDNA
        
        La lettura avviene alla fine della fase di estensione abbiamo la fluorescenza di interesse
        
        quindi quando la sonda che si era ibridata (intercettano ilcDNA di interesse) è stata degradata = fluo
        
        Fase di denaturazione
        
        Lettura in fase di denaturazione dopo aver fatto almeno 1 ciclo di estensione
        
        le sonde sono lineari
        
        nel 1° ciclo abbiamo RNA ibridato al cDNA che abbiamo sintetizzato
        
        95° separazione delle eliche abbiamo Dna a singolo filamento per poter ibridarsi con il primo primer
        
        Quindi abbiamo l'ibridazione del Primer F a seconda di dov'è disegnata la sonda
        
        se è disegnata sull'RNA con complementarietà all'Rna non avrete l'appaiamento della sonda perchè avrà la stessa sequenza del cDNA
        
        se la sonda invece è disegnta come sequenza di RNA quella sonda si appaierà al cDNA
- - - - Perchè ci sono dei fluorofori che sono Auto-Quenciati SE stanno vicini a residuo di guanosina
      - Funzionano in modo analogo alle sonde Amplifour cioè
        
        1_ Una sonda con un Primer legato
        
        2_ Sintesi del filamento
        
        3_ Primer Reverse permette lo stretching della sonda,
        
        quindi l’apertura della sonda e la lettura della fluorescenza stessa
      - Non esiste un Quencer
    - - perchè si è accorti che un determinato fluoroforo se sta vicino ad una guanina la guanina stessa fa da Q
    - - Costi diminuiscono = perchè deve sintetizzare una molecola solo con il fluoroforo che quando è chiusa deve avere che il fluoroforo è vicino ad una guanina.
    - - In fase di estensione